黃連解毒湯含藥血清對泡沫細胞ABCA1表達與膽固醇含量的影響

許麗婷 徐彬人 盛蒙 吳瓊 王文佳 田維毅 俞琦

【摘?要】?目的：觀察黃連解毒湯含藥血清對泡沫細胞中三磷酸腺苷結合盒轉運體A1（ABCA1）表達及膽固醇含量的影響，探討黃連解毒湯抗動脈粥樣硬化的可能作用機制。方法：SD大鼠給予大、中、小劑量黃連解毒湯灌胃后制備含藥血清。用氧化低密度脂蛋白（ox -LDL）誘導RAW264.7巨噬細胞分化為泡沫細胞，將細胞分為空白組、模型組、黃連解毒湯含藥血清大劑量組、中劑量組、小劑量組，每組1.5×106個細胞，分別加入無血清培養液和不同濃度含藥血清干預24h，總膽固醇及游離膽固醇試劑盒檢測細胞中膽固醇含量，實時熒光定量PCR檢測細胞ABCA1 mRNA的表達。結果：與模型組比較，黃連解毒湯含藥血清各劑量組泡沫細胞內總膽固醇（TC）含量明顯降低（P<0.05或P<0.01），大劑量組游離膽固醇（FC）含量顯著下降（P<0.01）;含藥血清各劑量組ABCA1 mRNA表達均明顯升高（ P<0.05）。結論：黃連解毒湯上調泡沫細胞ABCA1的轉錄與表達，促進膽固醇流出，可能是其抗動脈粥樣硬化的機制之一。

【關鍵詞】?黃連解毒湯;泡沫細胞;ABCA1;膽固醇;動脈粥樣硬化

【中圖分類號】R285?【文獻標志碼】 A?【文章編號】1007-8517（2020）6-0010-04

Abstract：Objective To observe the effect of serum containing Huanglian Jiedu Decoction on the expression of ATP-binding cassette transporter（ABCA1） and cholesterol content in foam cells.To explore the possible mechanism of action of Huanglian Jiedu Decoction against atherosclerosis. Methods SD rats were given Large， medium and small doses of Huanglian Jiedu Decoction to prepare drug-containing serum. RAW264.7 macrophages were induced to differentiate into foam cells by oxidized low density lipoprotein （ox-LDL）. The cells were divided into control group， model group， Huanglian Jiedu Decoction-containing serum high-dose group， medium-dose group， and low-dose group. 1.5×106 cells in each group were added to serum-free medium and different concentrations of drug-containing serum for 24h. The total cholesterol（TC） and free cholesterol（FC） kits were used to detect the cholesterol content in the cells， and the expression of ABCA1 mRNA was detected by quantitative real-time PCR.Result Compared with the model group， TC content in the foam cells of Huanglian Jiedu Decoction group was significantly decreased （P<0.01）， and the FC content in the high dose group was significantly decreased （P<0.01）. The expression of ABCA1 mRNA in serum dose group was significantly increased （P<0.05）.Conclusion Huanglian Jiedu Decoction up-regulates the transcription and expression of foam cell ABCA1 and promotes cholesterol efflux， which may be one of the mechanisms of its anti-atherosclerosis.

Key?words：Huanglian Jiedu Decoction; foam cells; ABCA1; cholesterol; atherosclerosis

黃連解毒湯由黃連、黃芩、黃柏、梔子四味藥物組成，是清熱解毒最具代表的方藥之一，具有瀉火解毒功效，主治熱毒充斥三焦之證。其臨床應用非常廣泛，對Ⅱ型糖尿病、動脈粥樣硬化、老年性癡呆等病癥有明顯療效[1-3]。現代研究證實，黃連解毒湯可通過抗炎、降血脂、抑制血管平滑肌細胞增殖等方面發揮抗動脈粥樣硬化作用[4]。但其對細胞內膽固醇含量的影響及作用機制尚不明確。三磷酸腺苷結合盒轉運體A1（ABCA1）是調控細胞膽固醇流出的有效途徑，其表達不足將導致巨噬細胞內沉積大量的膽固醇，加重動脈粥樣硬化病變。本研究擬采用黃連解毒湯含藥血清干預泡沫細胞，觀察黃連解毒湯含藥血清對泡沫細胞ABCA1蛋白及膽固醇含量的影響，探討黃連解毒湯是否通過調節ABCA1蛋白表達及泡沫細胞膽固醇流出而發揮抗動脈粥樣硬化作用。為其臨床應用提供實驗基礎和科學依據。

1?材料

1.1?細胞株?小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞，購自上海中僑新舟。

1.2?藥物與試劑?黃連、黃芩、黃柏、梔子購自同仁堂貴陽藥店，經貴州中醫藥大學生藥教研室鑒定為正品。胎牛血清（美國Hyclone公司），DMEM和青鏈霉素混合液（美國Gibco公司），氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL，廣州奕源生物），總膽固醇及游離膽固醇檢測試劑盒（北京普利萊基因技術有限公司），逆轉錄試劑盒（美國Invitrogen公司）。ABCA1和β-actin引物（上海生工生物工程）。

1.3?動物?健康SD大鼠24只，SPF級，雌雄各半，體質量（200±20）g，購自重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司，許可證號： SCXK-（ 軍） 2012-0011。

1.4?主要儀器?SW-CJ-1F超凈工作臺（蘇州凈化）;PCR 儀（美國ABI Applied Biosystems）;ELX800全自動酶標儀（美國BioTek公司），細胞培養箱（美國Thermo公司），倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）。

2?方法

2.1?制備黃連解毒湯含藥血清?上述藥材按傳統方法進行水煎煮，煎煮兩次，合并兩次濾液，即得黃連解毒湯水煎劑。調整濃度為相當于生藥2g/mL，置4℃冰箱備用。SD大鼠采用隨機數字表法分為正常組，黃連解毒湯大、中、小劑量組，每組6只。大、中、小劑量組分別以6、3、1.5g生藥/kg灌胃給藥，體積為1mL/100g（大鼠體重）;正常組給予等體積蒸餾水。2 次/d，連續7 d。末次給藥后股動脈采血，常規制備血清，56℃ 30min 滅活補體，0.22μm過濾除菌，-80℃冰箱保存備用。

2.2?細胞培養及分組?細胞復蘇后，用含10 %胎牛血清和1 %雙抗（青霉素+鏈霉素）的DMEM培養基培養RAW264.7細胞，計數并調整細胞濃度，取對數生長期的細胞進行實驗。以2×105個/m L的濃度接種于96孔培養板，用ox-LDL誘導RAW264.7巨噬細胞源性泡沫細胞模型后進行后續實驗[5]。細胞分為：空白組、模型組（培養液+80μg/mL ox-LDL）和黃連解毒湯大、中、小劑量組（20%黃連解毒湯含藥血清大、中、小劑量+80μg/mL ox-LDL）。每組設6個復孔，培養24h。

2.3?泡沫細胞油紅O染色?用PBS液洗滌各組細胞，用50%異丙醇進行固定，油紅O工作液染色15min后沖洗5min;蘇木精染色10min，沖洗，氨水返藍后顯微鏡下觀察，紅色顆粒為蓄積的脂質。

2.4?泡沫細胞中膽固醇含量的測定?裂解各組細胞，收集裂解細胞上清液，測定各組細胞內總膽固醇（TC）和游離膽固醇（FC）的含量。具體按膽固醇檢測試劑盒說明書操作。

2.5?RT-PCR檢測細胞ABCA1 mRNA的表達?收集細胞，用Trizol提取總RNA后，紫外分光光度計測定 RNA 的濃度以及純度。按逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄合成 cDNA，PCR條件： 95℃預變性 30s，95 ℃ 5 s、60℃ 40s，擴增40個循環。ABCA1引物序列為：上游：5′-TAC CAG CAT TAA GGA CAT GCA C-3′;下游：5′-TTT GAT CCG TTA CAC AGA CTG G-3′。反應結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析RNA，分析各組目的基因的灰度值，以目的基因與β-actin基因的比值代表ABCA1 mRNA的表達。

2.6?統計分析?應用SPSS 18.0軟件進行數據分析，計算結果以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為有統計意義。

3?結果

3.1?黃連解毒湯含藥血清對泡沫細胞的影響?油紅O染色顯示，空白組細胞無著色，模型對照組細胞形態呈空泡樣，泡沫細胞中有大量脂質蓄積。與模型組比較，黃連解毒湯含藥血清小、中和大劑量組泡沫細胞內脂滴顯著減少，大劑量組細胞內脂滴減少最明顯（見圖1）。

3.2?黃連解毒湯含藥血清對泡沫細胞中膽固醇含量的影響?與空白組相比，模型組細胞內膽固醇含量明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，黃連解毒湯含藥血清小、中和大劑量組細胞TC含量明顯下降（P<0.05或P<0.01）;黃連解毒湯含藥血清大劑量組細胞FC含量顯著降低（P<0.01），小和中大劑量組無明顯差異（見表1）。

3.3?黃連解毒湯含藥血清對泡沫細胞ABCA1 mRNA表達水平的影響?如圖2所示，與模型組比較，在黃連解毒湯含藥血清的干預下，隨著劑量的增加，細胞的ABCA1 基因表達明顯升高（P<0.01）。

4?討論

動脈粥樣硬化是引發心血管疾病的主要原因，可導致患病人群高死亡率。動脈粥樣硬化是一種由斑塊堆積引起的動脈內部狹窄的疾病，其斑塊的主要成分是脂肪、膽固醇、鈣和血液中其他物質。在動脈粥樣硬化的早期階段，隨著胞內的ox-LDL堆積、脂質負載，巨噬細胞轉為泡沫細胞。病理過程中泡沫細胞凋亡，將膽固醇釋放到血管中，促進動脈粥樣硬化病變[11] 。ABCA1是一種膜轉運蛋白，激活的ABCA1可促進游離膽固醇和磷脂外流形成HDL顆粒，從而影響膽固醇從巨噬細胞的流出，因此在AS的發病機理中起重要作用[12]。中醫認為動脈粥樣硬化主要的三大病理因素是濕熱、毒邪和痰淤。黃連解毒湯具有清熱燥濕、瀉火解毒之功效，主要用于治療三焦火毒熱盛的癥狀，可用于抵抗動脈粥樣硬化的病變進程[13]。本研究通過觀察黃連解毒湯含藥血清對泡沫細胞的作用效果，探討黃連解毒湯抗動脈粥樣硬化的作用機制。

本實驗中，與模型組比較，黃連解毒湯含藥血清組泡沫細胞的油紅O染色中脂滴顯著減少，且大劑量組脂滴減少最明顯，說明黃連解毒湯減少泡沫細胞內脂滴含量，且有劑量依賴性。與空白組相比，模型組細胞內膽固醇含量明顯升高。與模型組比較，黃連解毒湯含藥血清小、中和大劑量組細胞TC含量明顯下降;說明黃連解毒湯可以下調泡沫細胞脂滴含量，并有劑量依賴性。黃連解毒湯含藥血清大劑量組細胞FC含量顯著降低，小和中大劑量組無明顯差異。說明大劑量的黃連解毒湯可促進FC外排。與模型組比較，在黃連解毒湯含藥血清的干預下，隨著劑量的增加，泡沫細胞的ABCA1 基因表達明顯升高，說明黃連解毒湯可促進ABCA1基因的表達。

綜上所述，本研究發現黃連解毒湯上調泡沫細胞ABCA1的轉錄與表達，促進膽固醇流出，可抑制動脈粥樣硬化的進展。ABCA1可能是其抗動脈粥樣硬化的機制之一，這對臨床治療動脈粥樣硬化病變具有指導意義。

參考文獻

[1]邢淵，付小龍，辛燏，等.黃連解毒湯加減對2型糖尿病胰島素抵抗患者的臨床效果觀察[J].甘肅醫藥，2017，36（11）：941-942，968.

[2]李淑玲，馬春，楊麗華.黃連解毒湯治療頸動脈斑塊的臨床研究[J].中國中醫藥現代遠程教育，2017，15（15）：96-98.

[3]顧欣如，王宏潔，楊健，等.黃連解毒湯治療阿爾茨海默病作用機制研究進展[J].浙江中醫藥大學學報，2018，42（10）;829-835.

[4]項瑞，姜麗.黃連解毒湯抗動脈粥樣硬化物質基礎和藥理作用研究概況[J].中國藥房，2016，27（4）：547-549.

[5]王光明，李明強，王琪，等.連梅方含藥血清抑制氧化型低密度脂蛋白誘導的巨噬細胞泡沫化及機制研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2017，28（5）：564-567.

[6]CROSS R K，WILSON K T. Nitric oxide in inflammatory bowel disease[J]. Inflamm Bowel Dis， 2003， 9（3）：179-189.

[7]張智偉，田維毅.中藥對巨噬細胞源NO干預作用的研究進展[J].時珍國醫國藥，2013，24（1）： 202-203.

[8]羅超，沈立，呂昌.亥茅酚苷對脂多糖誘導巨噬細胞一氧化氮和白介素6表達的影響[J].中國免疫學雜志，2015，31（11）：1486-1489.

[9]JIA Q，CAO H，SHEN D， et al. Quercetin protects against atherosclerosis by regulating the expression of PCSK9， CD36， PPARγ， LXRαand ABCA1[J].Int J Mol Med， 2019， 44（3）：893-902.

[10]LIU M，CHUNG S， SHELNESS G S， et al. Hepatic ABCA1 deficiency is associated with delayed apolipoprotein B secretory trafficking and augmented VLDL triglyceride secretion[J]. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 2017， 1862（10 Pt A）：1035-1043.

[11] 魏偉超，金政，俊龍，等.清熱解毒法對新西蘭兔動脈粥樣硬化模型主動脈斑塊穩定性的研究[J/OL].中華中醫藥學刊：1-10[2019-10-06].

（收稿日期：2019-12-24?編輯：劉斌）