血漿Septin9甲基化檢測在結直腸癌中的診斷價值

陳 培，鄧欽木，李丹丹

（重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院檢驗科, 重慶 400010）

根據2017 全球癌癥數據庫，結直腸癌在惡性腫瘤中的發(fā)病率和死亡率分別為第四位和第二位[1]。2018年我國結直腸癌的新發(fā)病例數為52.15 萬人，因結直腸癌死亡患者4.79 萬人[2],并隨著經濟的發(fā)展和居民生活方式的西方化在不斷增加[3-4]。研究數據表明，如果每年對居民定期篩查，可以避免結直腸癌中60%的死亡，并且其五年生存率可以從46%提高至73%[5]。因此，結直腸癌標志物的精準檢測對臨床治療、預后評估具有重要意義。

目前，結直腸癌的常見篩查方法為Septin9 甲基化（methylated Septin 9，mSEPT9)檢測、大便隱血試驗（fecal occult blood test, FOBT）、癌胚蛋白（carcino embryonic antigen, CEA）檢測以及腸鏡檢查。其中FOBT 和CEA 的敏感度和特異度較低，在結直腸癌的早期篩查中應用價值有限[6]，腸鏡作為結直腸癌診斷的金標準，其特異度高，但是早期診斷不夠敏感，并且因其侵入性操作以及腫瘤異質性而應用有限。近年來，液體活檢在臨床上得到推廣，其具有非侵入式、易重復取樣以及無腫瘤異質性等優(yōu)點[7]。尤其是循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）,它與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關[8]。既往文獻報道，Septin9 基因甲基化與結直腸癌變過程密切相關[5]。本次研究擬通過熒光定量PCR 方法檢測血漿中mSEPT9 水平，探討mSEPT9對結直腸癌的診斷意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2019年6～11月在重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院接受腸鏡檢查的患者共100 例。將45 例經腸鏡和病理檢測確診為結直腸癌的患者作為結直腸癌組，納入標準：參照《中國臨床腫瘤學會（ESCO）結直腸癌診療指南(2019 版)》綜合診斷為結直腸癌的患者。排除標準：既往其他腫瘤病史，已接受放化療、手術治療或全身治療，妊娠期、哺乳期婦女。將55 例經腸鏡和病理檢測未診斷為結直腸癌的患者作為非結直腸癌對照組，包括結直腸腺瘤患者18 例，結直腸息肉患者27 例，結直腸無異常發(fā)現患者10 例。本次研究入選患者100例，男性45 例，女性55 例，年齡37 ～85 歲，平均年齡62.33±11.37 歲。45 例結腸癌患者均接受了mSEPT9 和CEA 檢測，其中31 例接受了FOBT 檢查。55 例非結直腸癌患者均接受了mSEPT9 檢測，其中39 例患者接受了FOBT 檢查，43 例患者進行了CEA 檢測。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑：Septin9 甲基化檢測試劑盒（北京博爾誠），大便隱血（FOBT）檢測試劑盒（四川沃文特），癌胚蛋白檢測試劑盒（上海羅氏）。

1.2.2 儀器：SLAN-96S 熒光定量PCR 儀（上海宏石），沃文特全自動分析儀FA160（四川沃文特），Cobas 6000 型化學發(fā)光分析儀（上海羅氏）。

1.3 方法

1.3.1 Septin9 甲基化檢測：檢測流程按照試劑說明書進行，具體步驟如下：（1）提取血漿DNA；（2）亞硫酸鹽轉化；（3）SLAN-96S PCR 儀上機；（4）按照試劑盒說明書對結果進行判讀。

1.3.2 大便隱血試驗：使用沃文特公司生產的自動化糞便分析儀上機檢測。

1.3.3 癌胚蛋白檢測：CEA 采用化學發(fā)光法檢測，結果由本院核醫(yī)學科提供。

1.4 統計學分析 采用SPSS Statistics 20.0 軟件進行統計分析，組間數據比較采用t 檢驗，組間率的比較采用χ2檢驗，不同診斷方法符合率的比較采用ROC 曲線。P ＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者年齡和性別分布情況 在100 例接受腸鏡檢查的患者中，結直腸癌組45 例，其中男性22 例，女性23 例，年齡35～82 歲，平均年齡61.89±12.50 歲；非結直腸癌組55 例，其中男性23 例，女性32 例，年齡43～85 歲，平均年齡62.69±10.48 歲。兩組間患者年齡差異無統計學意義（t=0.349, P=0.728），兩組間患者性別差異無統計學意義（χ2=0.500，P=0.480）。

2.2 結直腸癌組和非結直腸癌組中mSEPT9 檢測結果 見表1。結直腸癌組患者mSEPT9 陽性率為82.22%（37/45）。非結直腸癌組患者mSEPT9 陽性率為10.91%(6/55)，結直腸癌患者和非結直腸癌患者之間mSEPT9 檢測結果比較，差異有統計學意義（χ2=4.917, P ＜0.05）。將mSEPT9 檢測結果與臨床數據進行相關性分析顯示，mSEPT9 檢測結果與患者性別、年齡以及腫瘤部位無相關性(均P＞0.05)。

表1 mSEPT9 檢測結果與臨床特征關系[n=100，n（%）]

2.3 mSEPT9，FOBT 和CEA 在結直腸癌篩查中應用價值的比較 見表2。mSEPT9 在結直腸癌中篩查中的特異度(89.09%)和陽性預測值(86.04%)高于FOBT(75.00%, 75.61%)，其敏感度(82.22%)和陰性預測值(85.96%)高于CEA(42.22%, 60.61%)。

表2 三種檢測方法在結直腸癌篩查中的應用價值[%(95%CI)]

2.4 mSEPT 檢測結果與臨床病理分化程度關系 在低分化結直腸癌、中分化結直腸癌和高分化結直腸癌患者中，mSEPT9 的陽性率分別為80%（4/5），82.76%（24/29）和100%（2/2），另外，有9 例分化程度不明的結直腸癌患者，其mSEPT9 陽性率為78.78%（7/9）。統計學分析顯示，mSEPT9 檢測結果與臨床病理分化程度無相關性(χ2=0.447，P=0.800)。

3 討論

結直腸癌的發(fā)病率和死亡率在我國惡性腫瘤中分別位列第二和第五，大多數結直腸癌發(fā)現時已進入晚期，錯過了最佳治療時機。如果定期對居民篩查，可以顯著降低結直腸癌患者死亡率。液體活檢作為一種新興的檢測技術，在腫瘤的精準診斷和療效檢測中具有廣闊的前景，與傳統的穿刺活檢相比，其具有無創(chuàng)、低風險、低成本和高頻率檢測疾病進展等優(yōu)勢[7]。目前已發(fā)現DNA 甲基化在基因表達及細胞增殖等過程中起重要作用，為腫瘤的無創(chuàng)診斷和療效監(jiān)測提供了新的手段[8]。

Septin9 基因位于人類染色體17q25.3，Septin9蛋白能夠調節(jié)細胞成長，防止細胞分裂過快或以不受控制的方式進行分裂增殖，具有相應的抑癌作用[9]。在結直腸癌變過程中，Septin9-v2 啟動子區(qū)的CpG 島發(fā)生高度甲基化，并且基因DNA 從凋亡壞死的癌細胞釋放入外周血。因此，通過檢測外周血中Septin9 特殊啟動子區(qū)域的甲基化水平可 以 推測患結直腸癌的風險[3,5,9]。既往研究發(fā)現mSEPT9 檢測結直腸癌的敏感度為36.6%～95.6%,特異度為77%～98.9%，其中在我國結直腸癌患者中，mSEPT9 的敏感度為69%～88%, 特異度為87%～98%[3]。本次研究結果顯示，mSEPT9 檢測結直腸癌的敏感度為82.22%，特異度為89.09%，與上述文獻報道結果一致。mSEPT9 檢測診斷結直腸癌的敏感度明顯高于CEA(42.22%), 特異度高于FOBT(75%)。但是，mSEPT9 診斷結直腸癌的敏感度低于FOBT（100%）,與YAN 等[6]分析結果相反，可能是因為未對所有患者進行FOBT 檢測，以及患者采集糞便樣本時依從性較差，其采集手法對結果影響較大。mSEPT9 篩查結直腸癌特異度略低于CEA（93.02%），可能是因為沒有對全部患者進行CEA 檢測。另外，本次研究還發(fā)現mSEPT9 檢測結果與患者性別、年齡、病例分化程度等沒有相關性（P＜0.05）。

本次研究存在一些不足之處，未對所有納入病例進行FOBT 和CEA 檢測，未分析mSEPT9 水平與結直腸癌臨床分期的關系。另外，本次研究中在部分胃癌、肝癌、肺癌和胰腺癌患者中發(fā)現mSEPT9 檢測結果為陽性，但由于樣本量不足，未做詳細分析。

綜上所述，mSEPT9 作為一個新的結直腸癌標志物，具有較高的靈敏度和特異度，并且具有無創(chuàng)、采樣方便、方法穩(wěn)定等優(yōu)勢，可以作為臨床診斷結直腸癌的輔助手段。