2型糖尿病患者ABCA1 R219K基因多態(tài)性分布及其與血脂水平的相關性研究

洪雄新，李觀強，楊 輝，李小峰，萬彥彬，郭中秋，楊素珍

（深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院，廣東深圳 518172）

糖尿病是我國中老年人群常見的慢性病之一，主要是由于糖代謝異常引起的疾病，表現(xiàn)為血糖長時間持續(xù)處于較高水平，影響機體各器官功能，對血管造成嚴重危害，容易引發(fā)心腦血管疾病[1]。隨著對基因遺傳的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)三磷酸腺苷結合盒轉運子A1（ATP-binding cassette transporter 1，ABCA1）是高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）介導膽固醇逆轉的第一步[2]。目前發(fā)現(xiàn)ABCA1 基因多態(tài)性與冠心病、脂代謝異常等有密切關系，而2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者也與血脂異常有密切關系，因此部分學者認為ABCA1 基因多態(tài)性是否對T2DM 的發(fā)生和發(fā)展有關[3-4]。由于R219K 是ABCA1 基因常見的單核苷酸多態(tài)性變異，因此本文收集深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院90 例T2DM 患者標本進行研究，采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法檢測ABCA1 R219K 基因多態(tài)性，旨在探討T2DM 患者和正常人群的ABCA1 R219K基因多態(tài)性情況，以 及ABCA1 R219K 基因多態(tài)性與T2DM 患者及其血脂的關系，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2015年12月～2017年4月期間深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院收治的85 例2 型糖尿病患者作為研究組，另選取同期在深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院體檢中心進行體檢的90 例健康志愿者作為對照組。研究組中男性48 例，女性37 例，年齡42～76 歲，平均年齡54.2±4.5 歲。體質指數(shù)（body mass index，BMI）18.2～25.9kg/m2， 平 均BMI 22.5±1.8kg/m2。對照組中男性51 例，女性39 例，年齡40～79 歲，平均年齡53.8±4.8 歲。體質指數(shù)（BMI）18.5 ～25.6kg/m2， 平 均BMI 22.3±1.6kg/m2。兩組研究對象上述資料（性別、年齡以及BMI）均無差異（P ＞0.05）。本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準通過。

納入標準：①同意進行本研究并簽字的患者；②經(jīng)檢查符合2 型糖尿病診斷標準[5]的患者；③年齡在40 ～80 歲之間的患者。

排除標準：①高血壓、冠心病、腦梗死等患者；②血液疾病、惡性腫瘤、嚴重感染等其他疾病影響研究者；③同時參與其他研究的患者。

1.2 儀器與試劑 美國應用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn)的PCR 7500 儀；濟南鑫貝西生物技術有限公司生產(chǎn)的超凈工作臺；美國Sigma 公司生產(chǎn)的低溫冷凍離心機；北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-6B 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀；法國VL 公司生產(chǎn)的Uvitec 全自動凝膠成像系統(tǒng)；上海科技儀器廠生產(chǎn)的電熱恒溫水浴器。上海生物工程技術服務有限公司合成的引物序列以及PCR 反應試劑（包括PCR 緩沖液、dNTP Mixtur以及Tag 酶）；美國BBI 生物工程公司生產(chǎn)的瓊脂糖凝膠。

1.3 方法

1.3.1 基因測定：取患者肘靜脈血5ml，使用低滲溶血、三氯甲烷法抽取外周白細胞基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），多聚酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）-限制性片段長度多態(tài)性測定ABCA1 R219K 基因多態(tài)性。嚴格按照PCR 擴增和酶切步驟，對照試劑說明書進行參數(shù)設置，預變性94℃4min。反應循環(huán)：94℃50s，退火58℃50s，延伸72℃1min，共循環(huán)32 次。循環(huán)結束后72℃延伸10min。反應結束后瓊脂糖電泳鑒定后置于4℃中保存等待酶切。上游引物：5’-GTATTTTTGCAAGGCTACCAGTTACA TTTGACAA-3’；下 游引物：5’-GATTGGCTTCAG GATGTCCATGTTGGAA-3’。0.2ml Eppendorf 管 內(nèi)配置20μl 反應體系，包括10μl PCR 產(chǎn)物，2μl 10×Buffer R，3U 內(nèi)切酶Econ I，加入滅菌dd-H2O至20μl，振蕩搖勻。

1.3.2 血脂檢測：采集研究組患者清晨空腹靜脈血3ml，利用自動生化分析儀對患者進行血脂檢測。

1.3.3 觀察指標：對比兩組研究對象血脂水平，血脂指標包括總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipid-cholesterol，HDL-C）以及低密度脂蛋白膽固醇（low density lipid-cholesterol，LDL-C）水平。觀察兩組研究對象ABCA1 R219K 等位基因和基因型頻率情況，觀察研究組患者不同基因型間血脂水平情況，分析T2DM 患者ABCA1 R219K 基因多態(tài)性與血脂的關系。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，采用t 檢驗，計數(shù)資料用百分比表示，采用χ2檢驗，多組間對比采用方差分析，F(xiàn) 檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組研究對象血脂水平比較 見表1。通過對研究組和對照組的血脂水平進行比較，分析得出兩組研究對象TC，TG，HDL-C 以及LDL-C 水平比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P ＞0.05）。

表1 兩組研究對象血脂水平對比（mmol/L）

2.2 兩組研究對象ABCA1 R219K 等位基因和基因型頻率比較 見表2。通過對研究組和對照組進行比較，分析得出兩組研究對象ABCA1 R219K 等位基因和基因型頻率對比差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 兩組研究對象ABCA1 R219K 等位基因和基因型頻率對比[n（%）]

2.3 研究組不同基因型血脂水平情況比較 見表3。通過ABCA1 R219K 三種基因型之間血脂水平比較，TC，TG 以及LDL-C 水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；KK 基因型HDL-C 水平明顯高于RR 和RK 基因型，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；RR 和RK 基因型之間HDL-C 水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表3 研究組不同基因型血脂水平情況對比（mmol/L）

3 討論

ABCA1 基因是由2 261 個氨基酸組成的膜蛋白，人類ABCA1 基因位于染色體9q31 區(qū)，長度為149kb，包括50 個外顯子和49 個內(nèi)含子。其中第7號外顯子第1 051 位核苷酸G 變成A，使219 位精氨酸（R）變成賴氨酸（K），其與冠心病、血脂異常等疾病的聯(lián)系成為近年來臨床上研究的熱點內(nèi)容[6-7]。目前研究發(fā)現(xiàn)，ABCA1 作為膽固醇轉運體，會影響膽固醇代謝及高密度脂蛋白的代謝過程[8]。YAO 等[9]人研究發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)膽固醇水平會影響β 細胞功能，在ABCA1 缺乏后，胰島內(nèi)膽固醇明顯增加，胰島素分泌受損，這表明膽固醇的流出會導致β 細胞功能損傷。有學者將小鼠胰島β 細胞敲除，結果發(fā)現(xiàn)小鼠葡萄糖耐量明顯降低，胰島素分泌顯著減少，胰島膽固醇水平明顯升高[10]。提示胰島中膽固醇分泌增多可能會抑制胰島β 細胞功能，減少胰島素分泌量。通過上述研究，部分學者認為T2DM 的發(fā)生和發(fā)展可能與ABCA1 R219K 基因的多態(tài)性有相關性。這是由于T2DM 患者常常發(fā)生HDL-C 水平降低，LDL-C 水平升高[11]。近些年這種雙重血脂代謝異常的T2DM 患者數(shù)量逐漸增加，因此對ABCA1 R219K 基因多態(tài)性的研究成為當今醫(yī)學研究的重點內(nèi)容之一。

本文對深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院T2DM 患者和健康體檢者進行研究，結果顯示，研究組和對照組在血脂方面并無明顯差異。而在觀察兩組患者ABCA1 R219K 基因型時，發(fā)現(xiàn)兩組患者ABCA1 R219K等位基因頻率和基因型并無差異，這一結果表明ABCA1 R219K 基因多態(tài)性并不是引起T2DM 的遺傳學因素，可見ABCA1 R219K 基因多態(tài)性與糖尿病的發(fā)生發(fā)展并無關聯(lián)。但在近年來的研究中，有學者研究發(fā)現(xiàn)ABCA1 R219K 基因中RK 型攜帶者和KK 型的TG 水平明顯低于RR 型患者[12]。還有學者對腦卒中患者進行研究發(fā)現(xiàn)，KK 型攜帶者的HDL-C 水平高于RR 型攜帶者，但差異并無統(tǒng)計學意義。盡管目前臨床上對血脂異常與腦卒中的關系仍然存在較大爭議，但脂代謝紊亂依然被認為是腦卒中的危險因素。

目前國外有不少針對ABCA1 R219K 基因多態(tài)性與血脂關系的研究，但各學者的研究結果存在較大差異，結論也有明顯分歧，這可能是由于研究樣本的種族、生活習慣等因素有關。雖然ABCA1 R219K 基因多態(tài)性與血脂的關系尚未完全明確，但K 等位基因攜帶者TG 水平降低和HDL-C 水平升高是目前較為公認的結果。本文對T2DM 患者等位基因型之間進行研究，結果顯示，KK 基因型攜帶者HDL-C 水平明顯高于RR 型和RK 型攜帶者，提示ABCA1 R219K 基因KK 型可能參與了血脂異常的調節(jié)，也可能通過這一調節(jié)影響患者大血管病的發(fā)生和發(fā)展[13]。雖然目前ABCA1 R219K 基因變異引起血脂變化的機制尚未完全明確，但多數(shù)學者認為可能與ABCA1 活性的提高有密切關系[14]。還有學者研究發(fā)現(xiàn)，利用轉基因大鼠過度表達ABCA1 基因，大鼠膽固醇外流明顯增強，膽固醇酯、磷脂、HDL-C 水平等明顯升高，導致富含ApoE 的HDL集聚，是引起HDL-C 升高的原因[15]。

本次研究仍有不足之處，納入的樣本量較少，結果可能存在偶然性，而且部分研究對象的血脂水平數(shù)據(jù)并不能完全排除飲食干擾，還有本次研究的患者多為深圳及其周邊地區(qū)的患者，具有一定的區(qū)域局限性。

綜上所述，本次研究結果提示ABCA1 R219K基因多態(tài)性并不是T2DM 發(fā)病的遺傳學標志，但其變異參與了T2DM 患者脂代謝異常的調節(jié)。