基于TCGA數據庫卵巢癌患者的miR-301b表達量與生存狀況生物信息學分析

侯 娟，蔣樹立，滕長財（濱州醫學院附屬醫院，山東濱州 256603）

關鍵字：卵巢癌；miR-301b；抑癌因子;腫瘤基因圖譜數據庫

卵巢癌是女性中第五大致死的惡性腫瘤，截止2014年美國統計的新發病例為21 980 例，死亡人數為14 270 例，這其中90%為上皮性卵巢癌，而外科手術后聯合順鉑和紫杉醇化療的程序仍然是上皮性卵巢癌的標準治療方法[1-2]。因此，發現并研究卵巢癌發病的分子特性對于提出更好更有效的治療方法是必要的。

MicroRNAs 是一種可以調控基因表達的短的（～22nt）內源性的單鏈RNA 分子，成熟的miRNA和Argonaute 蛋白形成了RNA 誘導的沉默復合體（RISC），這種核糖核蛋白體的復合物調控了轉錄后基因的沉默，通過堿基配對的方式，miRNA 引導RISC 與信使RNA 結合，Ago 蛋白促使mRNA 降解或抑制其表達[3-4]。miRNA 的調控功能影響了細胞的信號通路，大部分這些通路控制著發育、細胞凋亡、增殖、分化和腫瘤的發展遷移等生理過程[5-6]。因此，干擾miRNA 的功能會影響到腫瘤的發生發展和治療。

miR-301b 作為一種促癌因子已在多種癌癥中被發現報道，如在胰腺癌中miR-301b 影響了轉錄因子的作用[7]，在三陰性乳腺癌和結腸癌中miR-301b出現高表達的結果[8]，在從巴雷特食管癌到食管腺癌的發展過程中，miR-301b 的表達量明顯升高[9]，而在急性髓系白血病病人的血漿中miR-301b 出現高表達，化療后表達量降低[10-11]。因此，對miR-301b 仍然不充分，為了進一步研究miR-301b 在卵巢癌中的作用，筆者用TCGA 數據庫的基因表達數據進行分析。

1 材料與方法

1.1 數據來源 通過在線數據庫獲取公開的臨床病例數據，并對臨床病例中miR-301b 的相關數據進行統計分析；預測miR-301b 的靶基因并進一步分析其生物學功能。文章中所涉及的數據庫見表1。478 例卵巢癌患者的臨床信息以及miR-301b 的基因表達信息全部來源于TCGA 數據庫,見表2。

表1 文章中應用到的數據庫及軟件

表2 478 例卵巢癌患者的臨床資料特征

1.2 數據收集整理 分析TCGA 數據庫中的478例卵巢癌患者的信息，miR-301b 進行單因素和多因素生存分析，判斷其是否與預后相關。478 例卵巢癌患者的總生存期（OS）定義為從診斷到死亡的生存時間，隨訪時間0～180 個月，中位隨訪時間是40 個月，無疾病進展生存（disease free survival，DFS）指手術開始至局部復發或遠處轉移或最后一次隨訪的時間。將478 例卵巢癌患者的臨床資料依年齡、美國癌癥聯合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC） 癌癥臨床分期、美國國家綜合癌癥網絡（National Comprehensive CancerNetwork，NCCN）腫瘤分級、腫瘤病發位置、術后腫瘤殘余等進行分類納入生存分析。

1.3 統計學分析 采用Graphpad Prism5.0 軟件和SPSS 21.0 軟件進行統計分析和繪圖。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，2組間均數比較采用t 檢驗。生存分析采用Kaplan-Meier 法，Log-Rank 分析生存差異。運用Cox 比例風險回歸模型分析卵巢癌患者的生存影響因素，P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 納入數據的基本特征 在TCGA 網站獲取478例卵巢癌患者的基因表達資料及臨床資料，見表2。年齡按照中位數分為高年齡組（≥59 歲）和低年齡組（＜59 歲）；臨床分期分為早期組（Ⅰ期+Ⅱ期）、晚期組（Ⅲ期+Ⅳ期）及未知；腫瘤等級分為低級別組（G1+G2）、高級別組（G3+G4）；病發位置分為單側組、雙側組；腫瘤殘余分為＜1.3cm 組和≥1.3cm 組；microRNA 按照表達量的中位數分為高表達組和低表達組。

2.2 單因素生存分析卵巢癌患者預后的影響因素見表3。對478 例卵巢癌患者的臨床數據進行單因素總生存分析和無進展單因素生存分析，得出miR-301b 的高表達是卵巢癌患者總生存和無進展生存的保護因素,差異有統計學意義（P＜0.05）。高年齡組是卵巢癌患者總生存的危險因素，差異有統計學意義（P＜0.05），而AJCC 分期晚期組是無進展生存的危險因素，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 多因素回歸分析卵巢癌預后的影響因素 見表4。以年齡（＜59 歲=0，≥59 發=1）、腫瘤等級（G1+G2=0，G3+G4=1）、病發位置（單側=0，雙側=1）、臨床分期（Ⅰ期+Ⅱ期=0，Ⅲ期+Ⅳ期=1，未知=2）、腫瘤殘余（＜1.3cm=0，≥1.3cm=1）、miR-301b（ 低表達=0， 高表達=1）為自變量，以生存結局（生存=1，死亡=0）為因變量，Cox 回歸分析顯示，miR-301b 高表達是卵巢癌患者總生存和無病生存的獨立影響因素，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表3 單因素分析478 卵巢癌患者預后因素與總生存和無進展生存的關系

表4 多因素Cox 回歸分析478 卵巢癌患者預后因素與總生存和無進展的關系

2.4 miR-301b 靶基因及作用位點預測分析 通過在線數據庫TargetScan, PicTar, miRanda 分別對miR-301b 進行靶基因的預測并得出預測結果，筆者在TargetScan 數據庫中預測得到432 個靶基因，在miRanda 中預測得到7 900 個靶基因，在PicTar數據庫得到469 個靶基因，綜合三個數據庫的預測結果，選擇在三個數據庫預測結果中均出現的靶基因，作為最終預測miR-301b 的靶基因。綜合預測結果得到12 個靶基因。筆者發現miR-301b與靶基因的結合位點均位于其mRNA 的3’UTR 區，在3’UTR 區與靶基因結合后抑制靶基因的翻譯，從而降低了靶基因的表達水平。筆者對這12 個靶基因進行生存分析發現，TEAD1 和CPEB4 的表達量與卵巢癌患者的預后相關，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 Kaplan-Meier 分析miR-301b 的表達量與卵巢癌患者預后的關系

3 討論

腫瘤的發生發展并不是由單一的基因突變引起的，它是多種突變長期累積的結果。卵巢癌作為一種致死性比較高的惡性腫瘤，它的發生發展及治療過程受多種基因的影響，根據不同的分子表型會采用不同針對性的治療方式。microRNA 作為一類內源性的具有調控功能的非編碼RNA，對細胞生長、組織分化、疾病過程起到重要的調控作用，尤其是腫瘤的發生發展。

miR-301b 作為一種對腫瘤具有重要作用的microRNA，在胰腺癌、肺癌等癌癥中miR-301b 作為一種促癌因子[14]，促進胰腺癌和肺癌等疾病的進展，并且預后較差。筆者通過對TCGA 中卵巢癌的臨床病例數據分析發現，miR-301b 高表達卵巢癌患者預后較好。miR-301b 在卵巢癌中表現出了抑癌基因的作用，與在胰腺癌、肺癌等癌癥中原癌基因的作用相反[14]，筆者認為出現這種情況是由于不同的腫瘤具有不同的分子表型，即使相同的分子在不同的腫瘤中具有不同甚至相反的作用。正是由于腫瘤的這種特性，在治療不同癌癥時會采用不同的治療手段，甚至相同部位的腫瘤會根據其分子分型的差異采取相應的治療措施。通過本文對miR-301b 靶基因的分析及靶蛋白相互作用的預測發現，部分靶蛋白及相互作用蛋白是與腫瘤的發生發展及治療具有重要意義的蛋白質。筆者對預測所得靶基因進行生存分析，發現TEAD1 與CPEB4 與卵巢癌的預后相關。先前研究發現在肝細胞癌和腎透明細胞癌中TEAD1 可以促進其癌細胞的增殖和轉移，與筆者的生存分析結果一致，高表達TEAD1 是卵巢癌預后的危險因素[15-16]。研究報道在神經膠質母細胞瘤、神經膠質瘤中以及骨肉瘤中均發現CPEB4 可以促進癌細胞的增殖轉移，同時發現CPEB4 在癌組織中的表達明顯高于其對應的癌旁組織。這些研究與筆者數據分析的高表達CPEB4 卵巢癌患者預后差的結果相一致，CPEB4 屬癌基因，其表達可以促進癌細胞的增殖，進而導致癌癥患者預后較差[17-19]。

miR-301b 表達量的變化會直接影響到其多種靶蛋白的表達，在細胞的信號網絡中，這些靶蛋白的變化會在細胞產生多種信號，并使細胞的生理過程，如細胞分化、細胞周期、細胞凋亡、細胞間的行為關系等發生變化，這些變化可能會使細胞朝向癌變的方向發展。miR-301b 對于卵巢癌的發生發展具有重要的作用，miR-301b 的研究對卵巢癌的診斷治療和預后評估具有重要的臨床指導意義。