新型冠狀病毒肺炎患者外周血淋巴細胞及其亞群檢測的臨床意義

劉艷霞，區靜怡，黃 穎，陳 星，陳意珊，江鴻雅，石亞玲

（廣州市第八人民醫院檢驗科，廣州 510440）

新型冠狀病毒性肺炎（coronavirus disease 2019,COVID-19）是2019年底新發現的傳染病，根據世界衛生組織(WHO) 報道， 2019年12月獲悉湖北省武漢市出現不明原因肺炎病例,中國宣布該不明原因肺炎的病原體為新型冠狀病毒。COVID-19臨床癥狀以發熱、干咳、乏力為主要表現，少數患者伴有鼻塞、流涕、咽痛等癥狀，嚴重者可出現呼吸困難，甚至危及生命。目前COVID-19 的診斷手段主要有病原學核酸檢測。2020年3月3日新型冠狀病毒（2019-nCoV）特異性抗體也納入確診的標準，包括了IgM 和IgG 在內的全部新型冠狀病毒抗體特異性抗體，既具有IgM 抗體檢測早期診斷的優勢，又具有檢測IgG 抗體既往感染的特點[1]。截至文章投稿前，尚未有針對性的治療方案用于臨床，對治療密切相關的實驗室檢查指標也在研究當中。近年來，許多研究報道顯示淋巴細胞亞群與呼吸系統疾病的發生發展之間存在著密切的關聯[2-3]。本研究通過對216 例COVID-19 患者外周血淋巴細胞及其亞群進行分析，探討兩者在COVID-19 患者中的臨床應用價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象 2020年2月14日～3月11日收治于廣州市第八人民醫院的216 例COVID-19 患者，其中普通組194 例（男性88 例，年齡15～91 歲；女性106 例，年齡16～82 歲），重型組15 例（男性11 例，年齡52～91 歲；女性4 例，年齡50～63歲），危重組7 例（男性5 例，年齡42～83 歲；女性2 例，年齡56～85 歲）。診斷依據國家衛生健康委員會《關于印發新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第六版）的通知》[4]，COVID-19 確診依據為新型冠狀病毒核酸檢測陽性，或病毒基因測序結果與已知的新型冠狀病毒高度同源。分型標準為：普通型：具有發熱、呼吸道等癥狀，影像學可見肺炎表現。重型需符合下列任何一項：出現氣促，RR ≥30 次/分；靜息狀態下，指氧飽和度≤93%；動脈血氧分壓（PaO2）/吸氧濃度（FiO2）≤300mmHg；肺部影像學顯示24～48 h 內病灶明顯進展＞50%者。危重型需符合以下情況之一：出現呼吸衰竭，且需要機械通氣；出現休克；并發其他器官功能衰竭需ICU 監護治療。

1.2 儀器與試劑 白細胞分類計數采用希森美康的SYSMEX XN B3 全自動血細胞分析儀及其配套試劑。淋巴細胞亞群的檢測采用美國BD 公司的FACS Canto ⅡPlus 型流式細胞分析儀、FACS 溶血素、淋巴細胞亞群檢測試劑盒（流式細胞儀法-6 色）及TruCOUNT 絕對計數管。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集：研究對象可能重復檢測，每份樣本作為獨立樣本檢測，本次研究的樣本總數共計1080 份，其中 799 份標本作白細胞與淋巴細胞計數檢測，281 份標本作淋巴細胞亞群樣本檢測。部分研究對象未行B 淋巴細胞和NK 細胞檢測。故B 淋巴細胞和NK 細胞的樣本數為普通組86 份，重型組12 份，危重組21 份。具體方法是空腹抽取靜脈血3ml 于EDTA-K2抗凝管中備用。

1.3.2 白細胞與淋巴細胞的檢測：SYSMEX XN B3全自動血細胞分析儀上機檢測。

1.3.3 淋巴細胞亞群的檢測：取抗凝標本50μl，放入TruCOUNT 絕對計數管,加入淋巴細胞亞群檢測試劑（流式細胞儀法-6 色）熒光標記抗體，振蕩混勻后，常溫避光孵育15min，分別加入450μl FACS溶血素（1X），振蕩混勻，常溫避光靜置10min，于BD FACS CantoⅡ Plus型流式細胞分析儀上機檢測。

1.4 統計學分析 采用SPSS 26.0 軟件進行統計分析，數據為非正態分布，采用中位數（四分位數）表示，組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 COVID-19 患者外周血淋巴細胞計數比較 見表1。COVID-19 患者外周血淋巴細胞計數結果為普通組＞重型組＞危重組，組間比較差異具有統計學意義（P ＜0.01）。白細胞計數結果為普通組＜重型組＜危重組，危重組與重型組、普通組比較，差異具有統計學意義（P ＜0.01）。

表1 COVID-19 患者外周血白細胞計數與淋巴細胞計數結果比較

2.2 COVID-19 患者的外周血淋巴細胞亞群水平比較

2.2.1 COVID-19 患者的外周血T 淋巴細胞計數、CD4+T 淋巴細胞計數和CD8+T 淋巴細胞計數比較：見表2。結果為普通組＞重型組＞危重組，重型組、危重組與普通組比較，差異具有統計學意義（P ＜0.01）；重型組與危重組比較（除外CD8+T淋巴細胞計數P ＞0.05），差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表2 COVID-19 患者外周血T 淋巴細胞亞群水平比較

2.2.2 B 淋巴細胞計數結果：見表3。為普通組＞危重組＞重型組，重型組、危重組與普通組比較，差異具有統計學意義（P ＜0.01）。NK 細胞計數結果為普通組＞重型組＞危重組，危重組與重型組、普通組比較，差異具有統計學意義（P ＜0.01）。

表3 COVID-19 患者外周血B 淋巴細胞和NK 細胞水平比較

3 討論

新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）是尚未完全被認識的新發傳染病，其傳染性強，人群普遍易感。目前，核酸檢測是確診COVID-19 的主要手段，實驗室檢查和影像學分析是疾病進展和療效評估的輔助參考。淋巴細胞是機體免疫應答功能的重要細胞成分，按其發生遷移、表面分子和功能的不同，可分為T 淋巴細胞、B 淋巴細胞和自然殺傷(NK)細胞。淋巴細胞亞群是細胞免疫和體液免疫功能的重要指標，它能總體反映機體的免疫功能、狀態和平衡水平，與多種疾病的發生發展存在密切的聯系。

大部分重癥急性呼吸綜合征（SARS）患者的淋巴細胞會減少，新型冠狀病毒（2019-nCoV）與蝙蝠SARS 同源性達85%以上，也有研究推測2019-nCoV 可能通過破壞免疫系統導致淋巴細胞減少[5]。有研究者提出，淋巴細胞減少在并發MODS 的患者持續存在；48 h 時循環淋巴細胞低于0.5×109/L 患者病死率高達45%，提示淋巴細胞數量可預測病情嚴重程度和預后[6]。表1 結果顯示，COVID-19 患者的外周血淋巴細胞計數水平均出現不同程度的降低，危重組淋巴細胞計數結果明顯低于重癥組與普通組（P ＜0.01）。結合本次研究結果與患者的臨床表現，對比相關研究結論，可以推斷淋巴細胞計數在預測COVID-19 患者病情進展方面具有一定的應用價值。有文獻報道COVID-19 早期白細胞計數減少或正常,隨著病情進展中性粒細胞數量增多，淋巴細胞進行性減少，在并發細菌感染時WBC 增高更明顯[7]。本研究白細胞計數在危重組中升高明顯（P＜0.01），重型組和普通組變化和差異并不明顯（P＞0.05），原因可能是由于危重組患者并發細菌感染或病情加重所致（病歷顯示危重癥患者中有4 例并發細菌感染，7 例伴有器官功能衰竭）。

隨著流式細胞術的發展，淋巴細胞亞群分析已廣泛應用于臨床，在免疫功能評估方面起到不可或缺的作用。T 淋巴細胞有不同功能的亞群，CD4+T 細胞可協助體液和細胞的免疫功能，發揮對抗細胞內病原體感染作用，CD8+T 細胞作為抑制細胞能夠抑制B 細胞產生的抗體。在受到病毒感染時，受到機體變應原的刺激可導致 CD3+T 細胞、CD4+T 細胞水平異常，反映了機體T 淋巴細胞亞群的紊亂狀態，一定程度上間接反映了機體細胞免疫功能的情況[8]。有文獻報道，淋巴細胞減少癥與高致病性引起的冠狀病毒相關[9]。還有報道提出，在COVID-19 患者中，T 淋巴細胞計數顯著減少，存活者 T 淋巴細胞似乎功能衰竭[10]。由表2 結果可見，COVID-19 患者的T 淋巴細胞、CD4+T 淋巴細胞與CD8+T 淋巴細胞的絕對值計數處于較低水平，以危重組的下降幅度最大。由此可見，T 淋巴細胞及其亞群計數水平降低的程度隨病情的加重而增加，該結果與國內外類似研究相符，提示T 淋巴細胞及其亞群的計數水平高低與COVID-19 患者病情輕重存在相關性，外周血T 淋巴細胞及其亞群計數水平可作為COVID-19 患者病情評估的一個指標。

B 淋巴細胞是參與獲得性體液免疫應答的主要細胞，在抗原刺激和 Th 細胞輔助下，B 淋巴細胞分化為漿細胞，產生抗體，行使體液免疫功能。表3 結果可見，普通組B 淋巴細胞絕對計數基本處于健康人群的參考范圍內，而重型組與危重組的B 淋巴細胞水平遠低于普通組（P ＜0.01）。由此推斷在COVID-19 患者中，B 淋巴細胞也可能存在損傷或者是被消耗。然而，B 細胞主要通過產生免疫球蛋白IgG，IgM 和IgA 等參與體液免疫，COVID-19患者中B 淋巴細胞的計數與體液免疫功能的關系、特異性免疫球蛋白產生的時間和效價、對疾病的診療和預后判斷有待進一步研究。

自然殺傷細胞（NK）是不同于T,B 淋巴細胞的大顆粒淋巴細胞，可以釋放多種細胞因子，對機體免疫功能進行調節，增強機體早期抗感染免疫能力。有研究指出，外周血自然殺傷細胞數量可用于預測全身性感染患者預后的情況[11]。本研究中，外周血NK 細胞計數水平在COVID-19 患者中也出現不同程度的降低，危重組降低最為顯著。因此NK細胞水平可考慮作為COVID-19 患者病情評估的一個指標。當然，NK 細胞水平存在明顯的個體差異，建議聯合其他指標綜合判斷。

綜上所述，對COVID-19 患者外周血淋巴細胞及淋巴細胞亞群進行分析，在反映COVID-19 患者機體免疫系統受損程度及評估病情方面具有一定的臨床應用價值。