三種化學發光法檢測新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）抗體試劑盒的臨床應用評價

胡紀文，王恩運，闞麗娟，豆小文，賴柚霞，徐 莎，姜瑞偉，張秀明

(深圳市羅湖醫院集團醫學檢驗中心，廣東深圳 518001)

新型冠狀病毒的流行和傳播已經成為影響世界各國的嚴重公共衛生事件，感染患者的“早發現、早隔離、早診斷、早治療”對控制疫情蔓延至關重要。新型冠狀病毒屬于β 屬的冠狀病毒，其基因特征與急性呼吸綜合征相關冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome-relatedcoronavirus，SARSr-CoV）和中東呼吸綜合癥冠狀病毒（middle east respiratory syndrome-relatedcoronavirus，MERSr-CoV）有明顯區別。有研究結果顯示，新型冠狀病毒與蝙蝠嚴重急性呼吸綜合征樣冠狀病毒（bat-SLCoVZC45）同源性達85%以上[1-2]，國際病毒分類委員會冠狀病毒研究小組將其命名為“嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒”（severe acute respiratory syndromecoronavirus 2，SARS-CoV-2）[3]，由 其 引發的疾病被世界衛生組織（World Health Organization，WHO）正式命名為新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）。從 目前的認知來看，在毒性上，新型冠狀病毒比SARS弱，而在傳染性上，新型冠狀病毒比SARS 更強。因新型冠狀病毒潛伏期長，無癥狀感染者也存在傳染性，且人群全部易感，因此研究快速且有效的實驗室檢測方法，對SARS-CoV-2 感染的篩查和診斷具有重要價值。《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》明確將抗體檢測結果納入確診病例的診斷標準，以及疑似病例的排除標準。如果疑似病例血清特異性IgM 和IgG 抗體陽性，IgG 抗體由陰性轉為陽性或恢復期較急性期有4 倍及以上升高，則可以診斷其感染了新型冠狀病毒。疑似病例的排除標準需要同時滿足病毒核酸檢測結果陰性以及發病7d 后新型冠狀病毒IgM 和IgG 抗體仍為陰性兩個條件[2]。化學發光免疫分析技術（chemiluminescence immunoassay，CLIA）檢測新型冠狀病毒血清IgM 和IgG 抗體具備高通量、方法穩定、安全性高、可以定量等特點而成為SARS-CoV-2 抗體檢測的主要手段。自疫情暴發以來，國內已有多個廠家生產的新型冠狀病毒血清IgM 和IgG 抗體化學發光檢測試劑盒在臨床上應用。本文評估比較了三個不同廠家化學發光法試劑盒對SARS-CoV-2 IgM 和IgG 抗體的檢測性能，并探討了抗體檢測對新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的臨床診斷價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2020年1～4月深圳市已確診的COVID-19 患者37 例為病例組，均為康復期患者，病程≥20 天；選取同期羅湖醫院門診和住院患者100 例作為對照組，核酸檢測均為陰性，臨床排除新型冠狀病毒感染。動態觀察1 例患者來自羅湖醫院發熱門診。實驗方案獲得羅湖區人民醫院倫理委員會批準。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器：實驗儀器分別采用新產業全自動化學發光測定儀（Maglumi 800）、博奧塞斯Axceed260化學發光測定儀和亞輝龍iModules 化學發光測定儀。

1.2.2 試劑：三種SARS-CoV-2 抗體化學發光檢測試劑盒分別為試劑A（IgM 批號：20200304；IgG批號：20200304）、試劑B（IgM 批號：G202004305；IgG 批號：G202004307）、試 劑C（IgM 批號：2722000202；IgG 批號：2722000201）。新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）核酸檢測試劑盒購自上海伯杰公司（批號：20200424C）。

1.3 方法

1.3.1 使用病毒采集管采集受試者鼻咽拭子標本，按照SARS-CoV-2 核酸檢測試劑盒說明書操作進行樣本處理、核酸提取和PCR 擴增。

1.3.2 采集受試者3 ml 靜脈血，置于含惰性分離膠的真空干燥管中，3 000 r/min 離心10 min 分離血清，檢測SARS-CoV-2 抗體。所有操作嚴格按照儀器和試劑盒說明書進行，結果判讀參照各試劑盒說明書。

1.4 統計學分析 運用GraphPad Prism 5 軟件繪制ROC 曲線，試劑A 的臨界值（Cut off 值）為S/CO ≥1 AU/ml，試 劑B 的Cut off 值 為≥1.0，試 劑C 的Cut off 值 為≥10 AU/ml；≥Cut off 值判定為陽性，＜Cut off 值判定為陰性，并計算靈敏度與特異度。采用SPSS22.0 軟件進行數據統計和分析。一致性分析采用Kappa 一致性檢驗，0 ≤Kappa ≤0.2 為微弱一致性，0.2 ＜Kappa ≤0.4為弱一致性，0.4＜Kappa ≤0.6 為中度一致性，0.6＜Kappa ≤0.8 為高度一致性，0.8＜Kappa ≤1.0為極強一致性。

2 結果

2.1 三種化學發光新型冠狀病毒抗體檢測試劑盒的性能評估 采用37 例臨床確診的COVID-19 患者康復期血清樣本和100 例對照組血清樣本對三種不同廠家的化學發光新型冠狀病毒抗體檢測試劑盒進行評估，結果顯示康復期COVID-19 患者血清IgM和IgG 水平顯著高于對照組。對于IgM 抗體檢測，除試劑C 外，試劑A 和試劑B 的AUC 值均大于0.9，表明試劑A 和試劑B 對于新型冠狀病毒IgM 抗體檢測具有非常好的檢測性能，尤其是試劑B 性能最優，臨床敏感度為56.76%，臨床特異度為99%。對于IgG 抗體檢測，三種試劑的AUC 值均大于0.9，均具有非常好的檢測性能，三種試劑的臨床特異度均為97.00%，而試劑C 的臨床敏感度最高，為97.29%。見圖1，圖2，表1。

圖1 三種化學發光試劑新型冠狀病毒IgM 抗體檢測性能

圖2 三種化學發光試劑新型冠狀病毒IgG 抗體檢測性能

表1 三種新型冠狀病毒化學發光試劑盒IgM 和IgG 抗體檢測性能評估

2.2 三種化學發光試劑盒檢測結果一致性評價 見表2，表3。利用Kappa 值對化學發光免疫分析法試劑A,B,C 的抗體檢測結果一致性進行評價。結果顯示，對于IgM 抗體檢測，試劑A 與試劑B 的Kappa 值最高，為0.508，試劑C 與試劑B的Kappa 值最低，為0.065，提示試劑A 與試劑B IgM 檢測結果具有中度一致性，試劑C 與試劑BIgM 檢測結果僅具有微弱一致性。對于IgG 抗體檢測，試劑A 與試劑C 的Kappa 值最高，為0.654，試劑A 與試劑B 的Kappa 值最低，為0.102，提示試劑A 與試劑C IgM 檢測結果具有高度一致性，試劑A 與試劑B IgM 檢測結果為弱一致性。

表2 三種化學發光試劑盒IgM 檢測結果的一致性分析

表3 三種化學發光試劑盒IgG 檢測結果的一致性分析

2.3 1 例患者新型冠狀病毒抗體水平和核酸水平變化的動態觀察 見表4。患者男性，32 歲，于2020年4月18日從武漢返回深圳，鼻咽拭子核酸檢測陰性，未做抗體檢測，在深圳某酒店隔離，隔離期間于24日再次采集鼻咽拭子核酸檢測仍陰性，但特異性IgM 和IgG 抗體陽性（試劑B），結合流行病學史和有輕微流涕，以疑似病例收入我院隔離病區。入院第3 天，核酸檢測仍為陰性，特異性IgM和IgG 抗體檢測仍為陽性。入院第5 天，新型冠狀病毒核酸檢測呈現非常弱的陽性（ORF1ab 基因Ct值38.36，N 基因Ct 值37.51，Cut-off 值≤38），經深圳市CDC 二次采樣咽拭子復核結果呈陽性。

表4 1 例新冠患者的抗體（S/CO）和核酸檢測的動態觀察

3 討論

當人體受到新型冠狀病毒感染時，免疫細胞會分泌產生特異性抗體。IgM 抗體在急性感染3～7 天后產生，可以反映機體是否處于急性感染早期；IgG 抗體在感染7 天左右開始產生，可作為診斷現癥感染和既往感染的指標；IgM 和IgG 抗體聯合檢測可以監測患者整個疾病過程中的抗體表達水平，同時檢測IgM 和IgG 抗體有助于提高檢測的陽性率[4-6]。抗體檢測可以作為核酸檢測的重要補充，在臨床診斷中也廣泛使用。但是由于疫情突發，研制抗體檢測試劑時間緊迫，導致臨床所使用試劑檢測性能存在較大差異，為此本研究對三種不同廠家的化學發光檢測試劑盒進行了評估和比較，以期為抗體檢測試劑的臨床應用提供借鑒。

目前SARS-CoV-2 抗體檢測試劑盒主要選擇刺突糖蛋白（spike glycoprotein, S）和核衣殼蛋白（nucleocapsid protein, N）融合片段作為包被抗原，也有單獨使用S 蛋白或N 蛋白作為包被抗原。S 蛋白是病毒感染人體細胞的武器[4]，針對S 蛋白受體結合區SRBD 蛋白的抗體具中和病毒的作用，采用SRBD 蛋白作為抗原檢測到的IgG 抗體的出現并持續升高，應具有很好的預后及康復指示價值。SARS-CoV-2 N 蛋白與SARS 病毒N 蛋白有高度同源性[7]，N 蛋白是冠狀病毒中產生最早且含量較多的蛋白質，具有較強的免疫原性和特異性，是抗體診斷材料的主要材料之一，由于N 蛋白抗體在發病10 天左右才開始大量產生，有研究認為N 蛋白抗體作為早期診斷指標可能存在一定的不足[8-9]。目前已有大量研究提示，不同種冠狀病毒N蛋白或S蛋白存在免疫交叉反應。因此，SARS-CoV-2 抗體檢測可受其他種類冠狀病毒的影響，可能具有一定的假陽性率，但還需在臨床檢測中進一步證實[10]。本研究結果顯示，三種試劑盒間的臨床敏感度及一致性有較大的差異，主要原因是不同廠家試劑盒選擇了不同的包被抗原以及采用不同的生產工藝，其中試劑A 采用S 蛋白與N 蛋白混合包被，試劑B采用S 蛋白包被，試劑C 采用S 蛋白與N 蛋白融合片段包被。除了包被抗原種類選擇的不同，不同廠家選擇的體外重組蛋白表達系統也有差異。體外重組蛋白表達系統主要包括真核表達系統和原核表達系統。其中原核表達系統以大腸埃希菌表達為主，真核表達系統包括哺乳動物細胞表達、酵母表達系統和昆蟲表達系統，不同的表達系統對于抗體檢測的敏感性和特異性也有影響。此外，針對抗體的不同檢測方法（雙抗原夾心法、間接法、捕獲法等）的差異也會對試劑盒的敏感度、特異度產生影響。因此產品性能的標準化和產品工藝的標準化亟待解決。

病毒核酸檢測作為診斷的“金標準”其特異度較其他方法學都高，但是目前的臨床應用中發現其出現不少假陰性的結果，這意味著一些感染了病毒的患者會被漏診，國外文獻報道假陰性率為2%～18%，主要原因包括目前PCR 技術存在低拷貝數漏檢問題、樣本采集不當導致檢測失敗、樣本提取過程因污染導致核酸降解[11-12]。而SARSCoV-2 特異性抗體可以作為核酸檢測的重要補充，若疑似患者的核酸檢測是陰性，可以對抗體進行連續監測，若抗體檢測出現陽性，應引起臨床的高度懷疑。在本研究中，動態觀察1 例患者SARSCoV-2 抗體（IgM,IgG）的抗體水平和核酸水平變化，該患者在首診和第3 天時核酸檢測均為陰性，但是IgM 和IgG 抗體呈現雙陽，且IgM 第3 天滴度比首診高1倍，高度疑似新型冠狀病毒感染。到第5天時，患者核酸檢測轉變為弱陽性，經過復核后最終確診。研究結果提示，對于此類臨床表現隱匿，且核酸水平非常低導致早期核酸檢測結果呈現陰性的患者，血清抗體水平動態監測有助于新型冠狀病毒感染的明確診斷，避免漏檢。

采用化學發光法檢測SARS-CoV-2 IgM 和IgG抗體有較高的敏感度和特異度，可以作為SARSCoV-2 篩查和診斷的有效手段[13。