兩株對萬古霉素敏感性減低金黃色葡萄球菌的透射電鏡下超微結構觀察

張 晨，朱海平，金鳳玲，孫虹佳，姚立瓊

（蘭州大學第一醫院a.檢驗科；b.感染管理科,蘭州 730000)

金黃色葡萄球菌是臨床出現下呼吸道醫院感染最常見的病原菌[1]，具有較強毒性，能夠引起皮膚黏膜、肺部、心內膜、骨關節等部位的感染性疾病，嚴重時可以引起膿毒性休克及敗血癥等[2]。萬古霉素自1958年應用于臨床治療革蘭陽性球菌感染，1961年耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）出現后[3]，萬古霉素更是成為治療MRSA 所致感染的最后一道防線，也是為數不多的對多重耐藥金黃色葡萄球菌有活性的藥物之一。近年來隨著MRSA 的迅速播散以及臨床治療中萬古霉素的濫用，萬古霉素敏感性減低金黃色葡萄球菌開始出現，包括耐萬古霉素金黃色葡萄球菌（VRSA）、萬古霉素中介耐藥金黃色葡萄球菌（VISA）及異質性耐萬古霉素金黃色葡萄球菌（h-VISA）[4]。1996年1月日本從一位MRSA 肺炎患者的痰液標本中分離出了首例h-VISA。同年，日本報道分離出第一株VISA[5]，而2002年美國更是出現了首例VRSA[6-7]，這引起了科學家的極大重視。2006年美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)將萬古霉素對金黃色葡萄球菌的折點更新為MIC ≤2 μg/ml 為敏感，4～8μg/ml 為中介，≥16μg/ml 為耐藥。

本試驗將前期基礎試驗中獲得的一株VISA 和一株h-VISA 通過K-B 法、瓊脂稀釋法、菌譜分析法等進行復核，并對檢出的兩株耐藥菌株進行透射電鏡觀察以了解其超微結構及耐藥機制。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 試驗菌株為課題前期試驗中分離出的兩株萬古霉素敏感性減低金黃色葡萄球菌，M1278 經鑒定為VISA，M1275 為h-VISA。金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC25923 購自甘肅省臨床檢驗中心。

1.2 儀器與試劑 法國Bio-Merieux 公司生產的VITEK32 細菌鑒定系統及配套鑒定試卡、美國Thermo Fisher 公司的二氧化碳培養箱等。鹽酸萬古霉素生產企業為Eli Lilly Japan K.K，Seishin Laboratories，有效期內使用，使用前用ATCC25923進行質控；萬古霉素(30μg) 藥敏紙片由英國OXOID 公司生產。腦心浸液肉湯（BHI）產于法國Bio-Merieux 公司；瓊脂粉為英國OXOID 公司產品。

1.3 方法

1.3.1 VISA 和h-VISA 的確認

1.3.1.1 K-B 法： 按照CLSI 推薦的K-B 法進行藥敏試驗, 采用MH 培養基，30μg 萬古霉素藥敏紙片，37℃ 孵育18 ～24h ,測量抑菌環直徑。

1.3.1.2 瓊脂稀釋法：在MIC ≥4μg/ml 的BHI-萬古霉素選擇性培養基上如出現1 個以上菌落生長，經質譜鑒定確定為金黃色葡萄球菌菌株，可初步認定為可疑h-VISA。

1.3.1.3 可疑菌落菌譜分析法[8]：試驗菌株M1278和M1275 在血平板上純培養24h, 取M1278 和M1275 的純培養菌落及標準菌株ATCC25923 用無菌生理鹽水配制成1010CFU/ml，再連續進行10 倍稀釋，配制成102～1010CFU/ml 的菌懸液。在含萬古霉素4～64μg/ml 的萬古霉素選擇性培養基上點種每個濃度的菌液10μl，37 ℃ 孵育, 分別于24h 和48h進行菌落計數，并計算其相應的變異頻率。變異頻率=每塊平板上生長的菌落數(CFU)/該平板所接種的細菌總量(CFU)。

1.3.2 耐藥穩定性實驗：取萬古霉素選擇性培養基上分離到的菌株,經鑒定為VISA 或h-VISA 后以常規方法接種于不含任何抗生素的MH 瓊脂平板,持續傳代9 代以上,再采用瓊脂稀釋法及E-test 法檢測該菌株的MIC。

1.3.3 質量控制：為防止假陽性的出現，每次試驗應使用金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC25923 作為對照，嚴格無菌操作，并用比濁儀準確控制菌懸液的濁度。

1.3.4 透射電鏡標本制備過程：挑取血瓊脂平板金黃色葡萄球菌標準株純培養菌落作為正常對照組。菌落分別用2.5ml/dl 戊二醛固定,PBS 漂洗3次（每次10min），再經餓酸固定，系列濃度丙酮+乙醇梯度脫水（每個濃度脫水10min ），環氧樹脂包埋、超薄切片、鉛鈾電子染色，透射電鏡觀察。

2 結果

2.1 K-B 法藥敏試驗結果 K-B 法藥敏試驗M1275和M1278 抑菌環直徑均為6。

2.2 VISA 和h-VISA 檢測結果

2.2.1 瓊脂稀釋法結果： 兩株菌（M1275 和M1278）在含4μg/ml 的萬古霉素選擇性培養基上能夠生長。

2.2.2 E-test 法復查MIC：用E-test 法對MIC 進行復查，M1275 和M1278 的MIC 均為4μg/ml。

2.2.3 萬古霉素敏感性減低金黃色葡萄球菌菌株菌譜分析：2 株菌均在萬古霉素選擇性培養基上有生長現象，結果見表1。

表1 2 株萬古霉素敏感性減低金黃色葡萄球菌菌株菌譜分析結果

根據HIRAMATSU的研究[5]，h-VISA 的 判斷標準為：①金黃色葡萄球菌原代菌的MIC 在1～4μg/ml,而子代亞克隆在≥8μg/ml 的萬古霉素選擇性培養基上生長，且變異率≥10-6。②或是在含4μg/ml BHI-萬古霉素選擇性培養基上接種10μl 1010CFU/ml 菌懸液，孵育48 h，出現1 ～30個菌落則可能為h-VISA。③該亞克隆在不含萬古霉素的培養基上連續傳9 代耐藥性不丟失[9-10]。通常h-VISA 的判斷標準為①③，但是由于操作繁瑣，工作量大，較難在臨床實驗室開展，因此HIRAMATSU 等[5]重新設計了h-VISA 的篩選方法，即②③。

由于本試驗采用的是改良前的實驗方去，所以要根據h-VISA 的判斷標準①③來判定篩出菌株是否是h-VISA，兩株菌M1275 和M1278 的原代MIC 都為4μg/ml，其子代也在≥8μg/ml 的萬古霉素選擇性培養基上能夠生長，但是M1278的變異率只有10-8，達不到10-6，所以，M1278為萬古霉素中介金黃色葡萄球菌（VISA），并可認為只有M1275 符合判斷標準①③，判定為h-VISA。

2.3 電鏡結果 見圖1。

圖1 電鏡結果

3 討論

萬古霉素中介金黃色葡萄球菌(VISA)可分為同質性和異質性VISA。同質性VISA 是指對萬古霉素MIC 在4 ～8μg/ml 的金黃色葡萄球菌，表現為所有細菌為單一萬古霉素中介的群體，在無萬古霉素的非選擇性培養基上能夠穩定傳代二十代以上。異質性VISA（h-VISA）是指金黃色葡萄球菌含有耐萬古霉素的子代，原代菌株對萬古霉素MIC僅為1～2μg/ml，而對萬古霉素 MIC ≥4μg/ml 的子代變異株可通過含4～6μg/ml 萬古霉素的心腦浸液(BHI)選擇瓊脂篩選出來，其出現的頻率是10-6或更高,該子代細胞亞群在無藥培養基上連續傳代9代以上仍能保持其耐藥性不變。VISA 和h-VISA 統稱為萬古霉素敏感性減低金黃色葡萄球菌。在前期實驗過程中篩選出的2 株菌（M1275 和M1278）MIC 為4μg/ml,均為上述萬古霉素敏感性減低金黃色葡萄球菌。

萬古霉素敏感性減低金黃色葡萄球菌在電鏡下的形態改變主要為細菌細胞壁增厚、表面凸起增多(見圖1)。金黃色葡萄球菌細胞壁結構主要是肽聚糖，由氨基糖N-乙酰葡糖胺和 N-乙酰胞壁酸交替組成，在電子顯微鏡下觀察細胞壁平均厚度約為20 ～40nm[11]。金黃色葡萄球菌對萬古霉素耐藥機制目前尚不明確，但有研究認為可能與金黃色葡萄球菌細胞壁增厚密切相關。1997年，平松啓一教授研究團隊首次報道了萬古霉素敏感度減低的金黃色葡萄球菌VISA 菌Mu50 ( MICvan=8) 和 hVISA 菌Mu3( MICvan=3)[5,12]，并應用透射電子顯微鏡觀察發現Mu50 細胞壁存在明顯增厚的現象，達到對照菌株的2 倍[12]。本實驗中M1278（VISA）的細胞壁厚度為(56.3±12.5)nm，較標準菌株ATCC25923的細胞壁厚度(12.5±12.5)nm 明顯增厚，且達2 倍以上。M1275（h-VISA）的細胞壁厚度為(31.3±18.8)nm，也較標準菌株ATCC25923 的細胞壁明顯增厚。

為進一步明確細胞壁增厚與金黃色葡萄菌對萬古霉素低度耐藥的相關性，隨后有崔龍洙等[13]研究者收集到7 個國家的16 株VISA ，研究發現這16 株VISA 均出現了細胞壁增厚，且增厚程度與糖肽類抗生素的MIC 值密切相關，其相關系 數為0.908，與替考拉寧的相關系數為0.655。國內也有研究得出相類似的結論[14]。關于細胞壁增厚與金黃色葡萄球菌對萬古霉素耐藥的關系目前認為可能有兩種機制[15]：一種為“親和誘捕”，普遍認為在增厚的細胞壁肽聚糖層上有大量D-丙氨酰-D-丙氨酸殘基存在，這些殘基與萬古霉素有著較強的親和力，可與大量萬古霉素結合，導致大部分的萬古霉素藥物分子結合在細胞壁外層肽聚糖的殘基上，而不能到達肽聚糖合成的活性部位，導致金黃色葡萄球菌對萬古霉素耐藥；第二種是“阻塞現象”，萬古霉素分子與金黃色葡萄球菌表面肽聚糖層上的D-丙氨酰-D-丙氨酸殘基的結合，結合體阻塞了肽聚糖層的網孔，阻止了其它萬古霉素分子繼續向細胞內滲透到達靶位，繼而導致金黃色葡萄球菌對萬古霉素耐藥。

本次實驗經透射電鏡顯示，M1275(h-VRSA)和M1278（VISA)與金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC25923 相比細胞壁明顯增厚，證明h-VRSA和VISA 對萬古霉素耐藥很可能是由于細菌細胞壁增厚所引起的。但仍需進一步進行PCR 試驗對兩株菌進行萬古霉素耐藥基因的檢測，以排除耐藥是因獲得萬古霉素耐藥基因所引起的可能性。前期實驗中獲得的VISA 和h-VISA 較少，可進一步對M1275(h-VISA)進行誘導，觀察隨著萬古霉素誘導濃度和誘導時間的增加，h-VRSA 誘導株的MIC 和細胞壁厚度是否相應的增加，以驗證本次電鏡結果。