分散誘導DNA-金銀納米團簇熒光增強和溫度傳感

韓鵬宇,魏春英

(山西大學 分子科學研究所,山西 太原 030006)

0 引言

貴金屬納米團簇通常包含幾個到幾十個金屬原子,粒徑大小與電子費米波長相當。這些固有的物理屬性使得貴金屬納米團簇具有分裂的電子能級結構,同時賦予了貴金屬納米團簇優良的光化學性質[1-3]。以樹枝狀大分子[4-5],聚合物[6-8],DNA[9-12],蛋白質[13-14]以及多肽[15-16]等為模板合成的貴金屬金和銀納米團簇因其熒光發射范圍寬(從紫外到近紅外區),生物相容性好,毒性低,斯托克斯位移大,穩定性好的特點而被廣泛應用于各種重金屬離子[17-19]和環境污染物的檢測[20-21],生物傳感[12,14,22-23]和細胞成像[8,13,16]。

雙金屬金/銀納米團簇(Au/Ag NCs)由于同時包含金銀兩種元素,其催化[24]、熒光強度[25]、離子強度耐受力[26]、檢測靈敏性[27]等性質因受“協同效應”和“銀效應”的影響而得到明顯改善。眾所周知,探針的熒光強度和穩定性等性質對檢測的靈敏性和檢出限有著顯著的影響,因此,對改善探針熒光性質因素的研究對于提升檢測靈敏性和檢出限具有重要意義。以DNA為模板合成金屬納米團簇的優勢在于可以通過簡單改變DNA序列來實現對金屬納米團簇熒光性質的調控[10,28]。到目前,被報道的用于合成Au/Ag NCs的模板DNA是一條富含胞嘧啶(C)的12堿基DNA序列(5’-CCCTTAATCCCC-3’)[26,29-30]。此外,關于乙醇對DNA-Au/Ag NCs熒光性質的影響以及DNA-Au/Ag NCs在溫度傳感方面的應用也鮮有報道。

本文以C-AGRO100 DNA為模板合成了熒光雙金屬金銀納米團簇(C-AGRO100-Au/Ag NCs),并進一步研究了溶液中乙醇對C-AGRO100-Au/Ag NCs熒光性質的影響以及C-AGRO100-Au/Ag NCs在溫度傳感方面的應用。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

試劑(含量均為質量分數):硝酸銀(AgNO3,99.8%),氯金酸(HAuCl4·3H2O, 49%基于金),硼氫化鈉(NaBH4, 98%),檸檬酸(C6H8O7·H2O,99%),檸檬酸鈉(Na3C6H5O7·2H2O, 98%),磷酸二氫鈉(NaH2PO4·12H2O, 99%),磷酸氫二鈉(Na2HPO4·2H2O, 99%),以上試劑購于上海阿拉丁生物科技有限公司;C-AGRO100 DNA,購于生工生物工程(上海)股份有限公司。

儀器:Cary 50 Bio紫外可見光譜儀(美國瓦里安公司);F-4600熒光分光光度計(日本日立高新技術公司);FL 920瞬態熒光光譜儀(英國愛丁堡儀器公司);Tecnai G2 F20 S-Twin型場發射透射電子顯微鏡(美國FEI公司);Nano ZS型納米粒度儀(英國馬爾文儀器有限公司);AXIS ULTRA DLD型光電子能譜儀(英國Kratos公司);Chirascan型圓二色光譜儀(英國應用物理公司)。

1.2 合成C-AGRO100-Au/Ag NCs

C-AGRO100-Au/Ag NCs通過文獻報道的方法合成[26],具體步驟如下:

將C-AGRO100 DNA(100 μmol/L,50 μL)、AgNO3(1 mmol/L,30 μL)和HAuCl4(1 mmol/L,30 μL)按摩爾比1∶6∶6依次加入200 μL檸檬酸緩沖(100 mmol/L,pH 5.0)溶液中,再加入175 μL去離子水稀釋到485 μL,移液槍吹打均勻后在4℃黑暗條件下孵育15 min,然后加入15 μL新鮮配制的NaBH4(1 mmol/L)溶液,劇烈震蕩1 min使反應液混合均勻,在4℃黑暗條件下反應3 h完成Au3+和Ag+的還原。將所得溶液通過分子截留量為3 kDa的超濾離心管在13 500 g的條件下超濾離心40 min以純化C-AGRO100-Au/Ag NC。產物用去離子水洗滌3次,然后分散在1 000 μL PBS(10 mmol/L,pH 5.0)溶液中,放置在4℃黑暗條件下備用。用于合成C-AGRO100-Au/Ag NCs的C-AGRO100 DNA,AgNO3,HAuCl4和NaBH4的終濃度分別為5, 30, 30, 15 μmol/L。

1.3 乙醇對C-AGRO100-Au/Ag NCs熒光性質的影響

在最優條件下合成的C-AGRO100-Au/Ag NCs經超濾離心后分別分散在含乙醇體積分數(0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、100%)的PBS(10 mmol/L,pH 6.0)溶液中,在4℃黑暗條件放置2 h后測其熒光和紫外-可見吸收光譜。

1.4 C-AGRO100-Au/Ag NCs熒光強度對溫度的響應

將制備好的C-AGRO100-Au/Ag NCs(10 μmol/L,2 mL)轉移到石英池中并在設定的恒溫下保持5 min,然后記錄相應的熒光光譜。溫度范圍設定為5～70℃,溫度梯度為5℃。將C-AGRO100-Au/Ag NCs的溫度在5和70℃之間循環10次,然后記錄相應的熒光光譜以研究C-AGRO100-Au/Ag NCs在5～70℃的溫度檢測范圍內的熒光可逆性。

2 結果和討論

2.1 C-AGRO1000-Au/Ag NCs的表征

在檸檬酸緩沖溶液中(pH 5.0)合成C-AGRO100-Au/Ag NC,然后分散在PBS (pH 5.0)中測試的紫外-可見吸收光譜如圖1(A)中的a曲線所示,在大約440 nm處有一弱的吸收峰。圖1(B)顯示了C-AGRO100-Au/Ag NCs在不同激發波長下的熒光光譜,當激發波長為440 nm時,最大發射波長位于600 nm處。由于C-AGRO100-Au/Ag NCs的熒光性質受pH的影響,因此我們分別優化了C-AGRO100-Au/Ag NCs的合成和測試緩沖pH。結果如圖2所示,C-AGRO100-Au/Ag NCs的最佳合成和測試緩沖pH均為6.0。此外,我們探究了在最佳pH條件下C-AGRO100 DNA濃度和Au3+/Ag+摩爾比對C-AGRO100-Au/Ag NCs熒光強度的影響。如圖3所示,當C-AGRO100 DNA、Au3+和Ag+的濃度分別為15、30和30 μmol/L時,C-AGRO100-Au/Ag NCs的熒光最強。當DNA濃度為10 μmol/L時,熒光強度略低,本著節約的原則,在后續實驗中使用的C-AGRO100 DNA濃度均為10 μmol/L。因此,用于制備具有高強度熒光C-AGRO100-Au/Ag NCs的C-AGRO100 DNA,Au3+,Ag+以及NaBH4的摩爾比為2∶6∶6∶3。

圖1 (A) 不同條件下制備的C-AGRO100-Au/Ag NCs的紫外-可見吸收光譜。(a) 在pH 5.0檸檬酸緩沖溶液中制備并在pH 5.0的PBS中測量(5 μmol/L);(b) 在pH 6.0檸檬酸緩沖溶液中制備并在pH 6.0的PBS中測量(10 μmol/L)。(B) pH 5.0檸檬酸緩沖溶液中制備并分散在pH 5.0的PBS中的C-AGRO100-Au/Ag NCs(5 μmol/L)在不同激發波長下的熒光光譜Fig.1 (A) UV-visible absorption spectra of C-AGRO100-Au/Ag NCs(a) C-AGRO100-Au/Ag NCs (5 μmol/L) prepared in citrate buffer (pH 5.0) and measured in PBS (pH 5.0) and(b) C-AGRO100-Au/Ag NCs (10 μmol/L) prepared in citrate buffer (pH 6.0) and measured in PBS (pH 6.0).(B) Fluorescence spectra of C-AGRO100-Au/Ag NCs (5 μmol/L) prepared in citrate buffer (pH 5.0) and measured in PBS (pH 5.0) under different excitation wavelengths

圖2 C-AGRO100-Au/Ag NCs在不同條件下的熒光光譜(A)pH 5.0檸檬酸緩沖中制備,在不同pH(5.0, 6.0, 7.0和8.0)的PBS中測量;(B)不同pH(4.0, 5.0, 6.0和6.6)檸檬酸緩沖中制備,在pH 6.0的PBS中測量Fig.2 Fluorescence spectra of C-AGRO100-Au/Ag NCs(A) prepared in pH 5.0 citrate buffer and measured in PBS with different pH (5.0, 6.0, 7.0, and 8.0);(B) prepared in citrate buffer with different pH (4.0, 5.0, 6.0, and 6.6) and measured in PBS with pH 6.0

圖3 在不同條件下合成的C-AGRO100-Au/Ag NCs的熒光光譜(A)以不同濃度的C-AGRO100 DNA為模板,在30 μmol/L HAuCl4、30 μmol/L AgNO3和15 μmol/L NaBH4存在的條件下合成;(B)以不同的金銀摩爾比在10 μmol/L C-AGRO100 DNA 和 15 μmol/L NaBH4存在的條件下合成Fig.3 Fluorescence spectra of the as-prepared C-AGRO100-Au/Ag NCs(A) NCs were prepared using the different concentrations of C-AGRO100 DNAin the presence of 30 μmol/L HAuCl4, 30 μmol/L AgNO3, and 15 μmol/L NaBH4,(B) NCs were prepared using the different molar ratio of Au3+:Ag+ in the presence of 10 μmol/L C-AGRO100 DNA and 15 μmol/L NaBH4

在最佳合成條件下合成的C-AGRO100-Au/Ag NC的紫外-可見吸收光譜如圖1(A)中的曲線b所示,與曲線a相比,紫外-可見吸收峰的位置發生藍移,在430 nm處出現了一個強吸收峰,但最大發射波長仍然位于600 nm(圖4)。C-AGRO100-Au/Ag NCs(PBS,pH 6.0)的熒光強度隨時間變化如圖4所示。發現在0～1 h內,C-AGRO100-Au/Ag NCs的熒光強度逐漸增大。這可能是由于C-AGRO100-Au/Ag NCs經超濾離心后發生了聚集,隨著時間延長C-AGRO100-NCs在PBS中逐漸分散,其熒光強度逐漸增強。0.5 h后,C-AGRO100-Au/Ag NCs的熒光強度趨于穩定(圖4插圖),表明該分散過程大約需要0.5 h。此后熒光強度在48 h內基本沒有發生變化,這表明C-AGRO100-Au/Ag NCs在PBS中具有很好的穩定性。C-AGRO100-Au/Ag NCs的XPS譜如圖5所示,電子結合能為84.1 eV和87.6 eV的峰分別對應于Au 4f7/2(Au(0))和Au 4f5/2(Au(I))[27];Ag的XPS譜中出現在368.7 eV和374.2 eV的峰分別歸屬于Ag 3d5/2(Ag(I))和Ag 3d3/2(Ag(0))[27]。結果表明合成的C-AGRO100-Au/Ag NCs同時含有金和銀元素。

圖4 C-AGRO100-Au/Ag NCs在黑暗條件下pH 6.0的PBS中熒光強度隨時間的變化,插圖是C-AGRO100-Au/Ag NCs的熒光強度在0～1 h內隨時間變化的非線性曲線圖Fig.4 Fluorescence intensity of the C-AGRO100-Au/Ag NCs changed with the increasing timein PBS at pH 6.0 in the dark.The inset is a plot of the fluorescence intensityof C-AGRO100-Au/Ag NCs over time in 0～1 h

2.2 溶劑中乙醇體積分數對C-AGRO100-Au/Ag NC熒光的影響

乙醇在溶劑中的體積分數用函數fe=Vethanol/V(ethanol+PBS)表示。如圖6(A)所示,C-AGRO100-Au/Ag NCs的熒光強度隨fe的增大而逐漸增強,當fe增加到70%時,熒光達到最強;隨著fe從80%增加到100%,熒光強度開始下降。C-AGRO100-Au/Ag NCs在不同fe溶劑中的紫外-可見吸收光譜如圖6(B)所示,吸收峰的位置未發生移動但強度發生了改變,特別是在fe=80%和100%溶液中吸光度明顯增加,這應該歸因于C-AGRO100-Au/Ag NCs發生聚集而產生的散射[31]。由于受表面配體DNA的保護,C-AGRO100-Au/Ag NCs不發生聚集并穩定地分散在PBS中[32]。PBS中大量乙醇的存在不僅改變了溶劑的極性,而且引起模板C-AGRO100 DNA的構象變化,進而影響C-AGRO100-Au/Ag NCs的聚集程度和分散性,導致C-AGRO100-Au/Ag NCs的熒光強度發生改變。

圖5 C-AGRO100-Au/Ag NCs的XPS譜圖。(A) Au的4f能級,(B) Ag的3d能級Fig.5 XPS spectra of Au 4f (A) and Ag 3d (B) for the C-AGRO100-Au/Ag NCs

圖A中的插圖顯示了C-AGRO100-Au/Ag NCs熒光強度隨fe的變化圖6 C-AGRO100-Au/Ag NCs在乙醇體積分數不同的PBS溶劑中的(A)熒光光譜(B)紫外-可見吸收光譜Fig.6 (A) Fluorescence spectra and (B) UV-vis absorption spectra of theC-AGRO100-Au/Ag NCs in mixed solvents of ethanol and PBS with different volume fractions;The inset showed the fluorescence intensity of the C-AGRO100-Au/Ag NCs changed with the increasing fe

進一步,我們測試了在PBS，含70%乙醇的PBS以及乙醇溶劑中C-AGRO100-Au/Ag NCs的圓二色光譜(CD)。如圖7所示,在PBS溶劑中,C-AGRO100-Au/Ag NCs有位于285 nm和255 nm的兩個特征吸收峰,與DNA的i-motif特征峰(288 nm和255 nm[33])相近。這表明在PBS溶劑中,C-AGRO100-Au/Ag NCs的模板C-AGRO100 DNA以一種類似于i-motif的構象存在。然而,在含有70%乙醇的PBS中,位于255 nm處的峰紅移至260 nm,285 nm處的吸收峰顯著下降;在乙醇溶劑中,兩個特征吸收峰幾乎消失。顯然,不同溶劑中DNA二級結構的變化導致C-AGRO100-Au/Ag NCs的聚集和分散程度改變。對于前者,C-AGRO100 DNA的構象更能有效抑制Au/Ag NCs的聚集,從而改善了C-AGRO100-Au/Ag NCs在溶劑中的分散性;而后者,C-AGRO100 DNA-Au/Ag NCs可能在乙醇中沉淀,從而導致熒光強度大幅下降。

圖7 C-AGRO100-Au/Ag NCs在不同溶劑中的CD譜Fig.7 CD spectra of C-AGRO100-Au/Ag NCsin the different solvents

為了進一步證實以上猜測,我們測試了C-AGRO100-Au/Ag NCs在PBS、含70%乙醇的PBS以及乙醇溶劑中的透射電鏡(TEM)和動態光散射。如圖8(A,B,C)所示,NCs在不含和含有70%乙醇的PBS溶劑中具有均勻的粒徑分布,平均粒徑分別大約是3.3 nm和2.0 nm;而在乙醇溶劑中, 觀察到NCs發生明顯聚集,平均粒徑約為4.5 nm。C-AGRO100-Au/Ag NCs在上述3種溶劑中的動態光散射譜圖更好地反映了NCs在溶液中的粒徑大小,如圖8(D)所示,分散在PBS,含有70%乙醇以及乙醇溶劑中的C-AGRO100-Au/Ag NCs的平均粒徑為分別約為(11.7±1.4) nm、(7.5±0.4) nm和(91.3±33.3) nm。因此,我們可以得出結論,溶劑中低濃度的乙醇可以通過促進C-AGRO100-Au/Ag NCs的分散來增強其熒光發射,而當乙醇含量超過閾值(fe=70%)時,C-AGRO100-Au/Ag NC因發生聚集而使熒光猝滅。

2.3 溫度對C-AGRO100-Au/Ag NC熒光的影響

制備的C-AGRO100-Au/Ag NCs表現出顯著的熒光溫度依賴性特點。如圖9(A)所示,在5～70℃的溫度范圍內,C-AGRO100-Au/Ag NCs的熒光強度隨溫度升高而逐漸降低,并且分別在5～30℃和30～70℃溫度范圍內熒光強度(F)和溫度(T)之間存在良好的線性關系(圖9(B)),線性擬合方程分別為F=1630.38-26.52T(R2=0.992)和F=1224.18-11.98T(R2=0.993)。此外,C-AGRO100-Au/Ag NCs的熒光強度在5℃和70℃之間連續循環10次后沒有發生明顯的變化(圖9(C)),這表明C-AGRO100-Au/Ag NCs的熒光在5～70℃溫度響應區間具有良好的可逆性。

圖8 C-AGRO100-Au/Ag NC在不同溶劑中的透射電鏡圖(A)PBS,(B)含有70%乙醇的PBS,和(C)乙醇溶劑,(D)C-AGRO100-Au/Ag NC在三種不同溶劑中的動態光散射譜圖Fig.8 TEM images of C-AGRO100-Au/Ag NC in PBS (A) andwith 70% ethanol (B) and ethanol (C), and their dynamic light scattering spectra in the three solvents (D)

圖9 (A)C-AGRO100-Au/Ag NCs在5～70℃溫度區間的溫度依賴性熒光光譜;(B)發射波長在600 nm的熒光強度與溫度的線性關系圖;(C)C-AGRO100-Au/Ag NCs 在5℃和70℃之間循環10次的熒光響應Fig.9 (A) Temperature-dependent fluorescence spectra of C-AGRO100-Au/Ag NCs in the range from 5℃ to 70℃;(B) The corresponding linear calibration curve at 600 nm;(C) The fluorescence responses of C-AGRO100-Au/Ag NCs upon cycling between 5℃ and 70℃ for ten cycles

表1 C-AGRO100-Au/Ag NCs在不同溫度下的熒光壽命

升溫誘導熒光猝滅的機理歸因于高溫下非輻射衰減的增強。具體而言,溫度升高導致分子碰撞頻率和其他非輻射能量轉移速率增加,而產生熒光的輻射能量轉移速率保持不變,這導致C-AGRO100-Au/Ag NCs熒光猝滅[34]。為了驗證該假設,分別測量了C-AGRO100-Au/Ag NCs在不同溫度下的熒光壽命。CAGRO100-Au/Ag NCs在不同溫度下的平均熒光壽命列于表1，熒光衰減曲線如圖10所示。C-AGRO100-Au/Ag NCs的平均熒光壽命從326.21 ns(10℃)下降到的148.62 ns(70℃),表明高溫加速了C-AGRO100-Au/Ag NCs的熒光衰減[35]。當然,溫度升高也會導致模板DNA構象發生變化,從而導致熒光強度的改變。

激發波長為405 nm,發射波長為600 nm圖10 C-AGRO100-Au/Ag NCs在不同溫度下的熒光衰減曲線Fig.10 Fluorescence decay curves of C-AGRO100-Au/Ag NCs at different temperatures.The excitation wavelength was 405 nm and emission wavelength was 600 nm

3 結論

本文以一條富含胞嘧啶(C)的C-AGRO100 DNA序列為模板成功制備了一種穩定的具有橙色熒光發射的雙金屬金/銀納米團簇(C-AGRO100-Au/Ag NC)。適量的乙醇可以改善所制備的C-AGRO100-Au/Ag NCs在PBS溶劑中的分散性從而增強其熒光發射。C-AGRO100-Au/Ag NCs的熒光信號分別在5～30℃和30～70℃的溫度區間對溫度表現出良好的線性響應,并且在5～70℃的溫度測量區間具有良好的可逆性,為C-AGRO100-Au/Ag NCs作為熒光納米溫度計在溫度測量方面的應用提供了潛在的可能性。