氮、磷共摻雜碳點在Fe3+檢測和細胞多色成像中的應用

李曉峰,李林,石利紅*,董川*,雙少敏

(1.太原學院,山西 太原 030032;2.山西大學 化學化工學院,山西 太原 030006)

0 引言

熒光碳點(CDs)是一種粒徑小于10 nm的新型熒光納米材料,由帶有羧基、羥基等基團的氧化碳殼和sp2雜化碳的無定形或結晶形的碳核組成[1]。與傳統的量子點相比,CDs成本比較低、粒徑相對較小、水溶性較好、易制備,并且綠色環保[2-8]。碳點這些優異的性質使其應用于諸多領域,如光催化[9-10]、重金屬離子檢測[11-15]、化學和生物傳感器[16-21]、生物成像[22-24]、藥物傳送等[25]。

近年來,研究者們在制備CDs的方法上不斷探索創新,將CDs和各種雜原子摻雜,從而增強碳點熒光并拓寬其應用。Wang等[26]用檸檬酸為碳源、乙二胺為氮源,制備了量子產率高達41.3%的氮摻雜熒光碳點。Gong等[27]用南瓜和磷酸在90℃下反應1 h得到了氮、磷共摻雜的黃色熒光碳點。Xu等[28]將檸檬酸鈉溶液和氯化鋅溶液混合,通過水熱反應合成了鋅摻雜碳點。以上方法利用不同碳源和摻雜劑合成了雜元素摻雜的碳點,提高了碳點的熒光性能。但是,上述報道的方法制備過程煩瑣,摻雜劑多為有毒化學試劑,不利于碳點在生物方面的應用。所以開發一種成本低、綠色環保、簡單的摻雜碳點的制備方法是一個具有挑戰性的課題。

鐵作為人體內含量最豐富的必需過渡金屬元素,在氧運輸、轉錄調控、氧代謝和電子傳遞等許多生物學過程中都發揮著重要的作用[29-30]。鐵攝入量不足和過量都會導致一些疾病,甚至危及生命。例如,過量的鐵攝入由于自由基的形成會導致組織損傷。但鐵的缺乏也會導致各種疾病,如胰腺、心臟、阿爾茨海默病、潘金森病和肝病等[31-33]。因此,測定鐵離子對這些疾病的早期識別和診斷具有重要意義。目前鐵離子測定的方法主要有高效液相色譜法、伏安法和熒光光譜法等。而熒光光譜法由于具有低成本、易操作和快速檢測等優勢,受到了研究者們的更多青睞。近年來,碳點作為熒光探針已被用于鐵離子檢測[31，34-37]。我們課題組開發了未摻雜[38]和氮摻雜[39-40]的熒光碳點鐵離子探針。

本研究選擇杏仁為碳源,通過熱解-水熱法無須表面修飾或表面鈍化直接合成了氮、磷共摻雜的熒光碳點(N,P-CDs)。采用杏仁為原料制備熒光碳點的優點在于:原料成本低廉、綠色環保;本方法是在不添加任何其他化學試劑的情況下,僅采用杏仁為單一碳源就實現了氮、磷共摻雜,得到了具有較高熒光量子產率的碳點。合成的N,P-CDs具有好的生物相容性、高的光穩定性和低的毒性,并且對Fe3+表現出高度選擇性。基于這些特性,我們將N,P-CDs應用于活細胞中Fe3+傳感及細胞多色成像。

1 實驗部分

1.1 主要試劑與儀器

杏仁(山西,中國);NaH2PO4、Na2HPO4、濃HNO3、濃HCl、MnCl2、NaCl、NiCl2和 ZnCl2、AlCl3、BaCl2、CaCl2、CdCl2、CoCl2、CuCl2、FeCl3、HgCl2、KCl、MgCl2;硫酸奎寧;3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)。所有試劑為分析純,實驗用水為去離子水。

透射電子顯微鏡(JEOL JEM-2100);紫外-可見分光光度計(普析TU-1901);熒光分光光度計(F-280);X射線光電子能譜儀(AXIS ULTRA DLD);熒光光譜儀(FLS920);激光共聚焦儀(Olympus)。

1.2 實驗過程

1.2.1 碳點的制備

用杏仁作為碳材料,采用熱解-水熱法合成N,P-CDs。具體步驟如下:將盛有6 g杏仁的坩堝放在馬弗爐中,于300℃下熱解2 h。然后將熱解產物研細成粉。稱取0.1 g該粉末將其分散于20 mL的去離子水中,攪拌制得混合液,再轉移到水熱反應釜中,在200℃,4 h的條件下水熱反應。待冷卻至室溫后,將懸濁液體用離心機離心,將離心得到的溶液放入透析袋(截留分子量為500～1 000 Da)在去離子水中純化48 h,最終得到熒光碳點水溶液。最后冷凍干燥得到N,P-CDs固體粉末。

1.2.2 量子產率的計算

通過將標準物質硫酸奎寧溶于0.1 mol/L硫酸中(量子產率為54%)作為參比溶液,來計算碳點溶液的量子產率。

1.2.3 Fe3+的檢測

Fe3+選擇性檢測在Tris-HCl緩沖液中進行。操作如下:在500 μL Tris-HCl緩沖液中加入50 μL碳點水溶液(1.6 mg/mL),然后分別加入2 μL濃度為 0.1 mol/L的不同金屬離子溶液(CoCl2、CuCl2、KCl、AlCl3、FeCl3、HgCl2、MgCl2、BaCl2、CaCl2、CdCl2、MnCl2、NaCl、NiCl2和 ZnCl2),設定激發波長為350 nm,測定熒光發射光譜。重復測試3次。

知行合一是習總書記非常重視，多次強調的教育理念。習總書記曾經指出：“貴在堅持知行合一、堅持行勝于言，在落細、落小、落實上下功夫。要注意把社會主義核心價值觀日常化、具體化、形象化、生活化，使每個人都能感知它、領悟它，內化為精神追求，外化為實際行動，做到明大德、守公德、嚴私德。”而將思政教育納入學科競賽體系正是以知行合一精神貫徹社會主義核心價值觀的重要舉措。對于文科學生而言，知行合一重在行，很多文科生的知識被停留在課堂上和課本上，而不是運用到生活和工作實踐中，而學科競賽為文科學生提供了學以致用的舞臺。

Fe3+的靈敏度檢測的步驟如下:在500 μL Tris-HCl緩沖液中加入50 μL碳點水溶液(1.6 mg/mL),然后再加入2 μL不同濃度的Fe3+標準溶液,設定激發波長為350 nm,測定熒光發射光譜。重復測試3次。

1.2.4 細胞成像

首先,在 37℃、體積分數5% CO2的條件下,含質量分數10%胎牛血清(FBS)的 DMEM 中培養人肝細胞癌(HepG2)細胞12 h。再將碳點水溶液(300 μL, 1.6 mg/mL)用移液槍慢慢加入培養液(1.0 mL)中,培養 1 h。選取pH為7.4的Tris-HCl緩沖液洗滌細胞3次,并保持在Tris-HCl緩沖液中使用激光共聚焦儀進行細胞成像。

2 結果與討論

2.1 碳點的制備

用杏仁作為碳源通過熱解-水熱法成功制備了N,P-CDs(如圖1)。杏仁經熱解后獲得的碳點呈現出較弱的藍色熒光,為增強其熒光,需要進一步進行水熱處理。我們推測在高溫高壓下水熱處理可能有助于碳點的粒徑均勻和表面官能團增加,從而表現出更好的熒光性能[41]。使用硫酸奎寧作為參比,測得經熱解和水熱處理制得的碳點的熒光量子產率分別為12.3%和20.4%。

2.2 碳點的表征

2.2.1 碳點的形貌表征

圖2為使用TEM對N,P-CDs的粒徑分布和形貌進行表征。圖2A、2B、2C分別為不同比例尺下(100、50和20 nm)N,P-CDs的TEM圖。從圖中可看出,N,P-CDs呈球形且分散均勻。圖2A的插圖表明N,P-CDs的粒徑分布窄,大多集中在3～9 nm范圍內。對上百個碳點進行統計分析,得出N,P-CDs的平均粒徑為(5.47±0.60) nm。圖2D為N,P-CDs的高分辨TEM(HRTEM)圖,從圖中可看出N,P-CDs有明顯的晶格結構,晶格間距大約為0.2 nm,可歸于石墨的102晶面。圖3為使用AFM對N,P-CDs表面的高度和分布情況進行分析。從AFM的表征結果可看出,N,P-CDs的高度主要集中在2 nm附近。

圖1 碳點的制備過程示意圖Fig.1 Schematic illustration for the preparation of N, P-CDs from pyrolysis of apricot kernel and the PL enhancement by hydrothermal treatment

2.2.2 碳點的結構特征

圖2 (A)N,P-CDs的TEM圖(比例尺為100 nm),插圖:N,P-CDs的粒徑分布圖;(B)N,P-CDs的TEM圖(比例尺為50 nm);(C)N,P-CDs的TEM圖(比例尺為20 nm);(D)N,P-CDs的HRTEM圖(比例尺為2 nm)Fig.2 TEM images of N,P-CDs with scale bar of 100 nm (A) (Inset: corresponding size distribution histogram);scale bar of 50 nm (B); scale bar of 20 nm (C);(D) HRTEM of N,P-CDs with scale bar of 2 nm

圖3 N,P-CDs的AFM 圖(A) N,P-CDs (5 μm×5 μm)的平面圖;(B) N,P-CDs (5 μm×5 μm)的三維圖像;(C) N,P-CDs (5 μm×5 μm)的平面圖。(D) 圖3c中直線N,P-CDs的高度分布Fig.3 AFM images of N,P-CDs(A) flat view of N,P-CDs (5 μm×5 μm);(B) 3D image of N,P-CDs (5 μm×5 μm);(C) flat view of N,P-CDs (5 μm×5 μm); (D) the altitude distribution of N,P-CDs of straight line in Fig. 3C

2.2.3 碳點的紫外-可見吸收和熒光發射光譜

為了考察N,P-CDs的光學性質,我們做了紫外吸收光譜和熒光光譜。從N,P-CDs的紫外-可見吸收光譜圖(圖5A)可看出,沒有明顯的吸收峰。從N,P-CDs的熒光發射光譜圖中可看出:在 350 nm 激發下,在 440 nm 處出現熒光峰。從圖5B可看出:當激發波長逐漸增加的時候,N,P-CDs熒光峰強度呈現先增加后降低,同時熒光峰位置發生紅移。

2.2.4 碳點的熒光壽命和穩定性

熒光壽命是碳點返回基態之前在激發態停留的時間,以納秒計量。圖6A為N,P-CDs的熒光衰減曲線,通過擬合、計算可知N,P-CDs熒光壽命為6.307 3 ns。我們還對N,P-CDs的光學穩定性進行了研究。圖6B為pH值對N,P-CDs熒光峰強度的影響,從圖中可看出,pH值在3.0到10.0的范圍內,N,P-CDs的熒光峰強度變化不大。說明所制得的N,P-CDs具有強的抗酸堿性。為了將該碳點應用于實際,還考察了在紫外燈下照射1.5 h和貯存放置3個月過程中N,P-CDs的熒光強度(圖6C和圖6D)。從圖中可看出:紫外輻射時間和貯存時間對N,P-CDs的熒光峰強度幾乎沒有影響。說明所制得的N,P-CDs的穩定性良好。

2.3 碳點的應用

2.3.1 水溶液中N,P-CDs的Fe3+傳感

Fe3+可以猝滅熒光,因此我們可以基于N,P-CDs熒光猝滅法檢測Fe3+。pH 7.4時,在N,P-CDs的溶液中加入不同的離子(Co2+、 Cd2+、Cu2+、Ni2+、Ca2+、Fe3+、Ba2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、K+、Al3+、Hg2+和 Na+),觀察熒光強度的變化。如圖7A所示,Fe3+對N,P-CDs表現出明顯的熒光猝滅效應,其他金屬離子對N,P-CDs的熒光強度影響不大,說明我們合成的N,P-CDs對Fe3+有很好的選擇性,可將其設計成Fe3+熒光探針。FTIR和XPS顯示制備的N,P-CDs表面含有羧基和氨基,這種猝滅可能是由于Fe3+與N,P-CDs表面的羧基絡合作用導致的。

圖4 (A)為N,P-CDs的XPS譜圖;(B)、(C)、(D)和(E)分別為N,P-CDs的 C1s O1s,N1s和P2P譜圖;(F)為N,P-CDs的 FTIR 譜圖Fig.4 (A) XPS spectrum of N,P-CDs, (B) C1s , (C) O1s, (D) N1s和(E) P2p spectra of N,P-CDs, (F) FTIR spectrum of N,P-CDs

圖5 (A)N,P-CDs的吸收光譜圖、熒光激發和熒光發射光譜圖。(B)不同激發波長下的熒光發射光譜圖。插圖為相對應的歸一化光譜圖Fig.5 (A) UV-vis absorption, PL excitation and emission spectra of N,P-CDs,(B) PL spectra of N,P-CDs at different excitation wavelength.Inset: corresponding normalized spectra.

圖6 (A)N,P-CDs的熒光衰減曲線,(B)pH對N,P-CDs熒光強度的影響,(C)紫外輻射時間和(D)貯存時間對N,P-CDs 熒光強度的影響。Fig.6 (A) Fluorescence decay of N,P-CDs (excitation at 340 nm, emission at 438 nm).Influence of pH (B),excitation time (C) and storage time (D) on the PL intensity of N,P-CDs

圖7 (A)金屬離子對N,P-CDs在438 nm處的熒光強度比值F/F的影響,(B)N,P-CDs在不同濃度Fe3+ (0.05～400 μmol/L)存在下的熒光光譜圖。(C)N,P-CDs熒光強度比值F/F與Fe3+濃度的線性關系圖(插圖:10～400 μmol/L的線性圖)。Fig.7 (A) Effect of different metal ions on F/F0 of N,P-CDs solution at 438 nm.(B) Fluorescence emission spectra of N,P-CDs with different concentrations of Fe3+ (0.05～400 μmol/L);(C) The relationship between F/F0 and Fe3+(0.05～400 μmol/L).Inset: the good linearity in the range of 10～400 μmol/L

我們還考察了不同濃度的Fe3+對N,P-CDs熒光強度的影響。圖7B是熒光滴定曲線,圖7C是相對熒光強度(F/F)和Fe3+濃度之間的關系。結果表明:隨著Fe3+濃度的增加,N,P-CDs的熒光強度逐漸降低,在10～400 μmol/L范圍內,N,P-CDs的熒光強度與Fe3+濃度呈現很好的線性關系,線性范圍較文獻中的更寬(表1)。并且在信噪比為 3的情況下,計算可得檢出限為3.3 μmol/L。

2.3.2 活細胞中N,P-CDs的Fe3+傳感

我們通過激光共聚焦來研究HepG2細胞內Fe3+的熒光成像。用N,P-CDs孵育的細胞呈現明亮的藍色熒光,當加入Fe3+之后,細胞的熒光強度降低。由此表明,我們可以將該N,P-CDs應用于細胞內的Fe3+的監測(圖8)。

2.3.3 細胞多色成像

圖9為HepG2細胞的共聚焦熒光顯微圖像。圖9A、9B和9C分別為HepG2細胞在405、488和514 nm激發下的熒光場照片,收集的熒光發射區域分別為 425～475 nm、500～540 nm和620～700 nm;圖9D為圖9A和圖9B的疊加;圖9E為圖9B和圖9C的疊加;圖9F為圖9A和圖9C的疊加。從圖中可看出:N,P-CDs可以很好地標記HepG2細胞。分別用405 nm、488 nm和514 nm激光激發,細胞分別呈現明亮的藍色、綠色和紅色熒光,實現了細胞的多色成像。因此,這種熒光碳點可作為優良的熒光探針應用于生物成像。

表1 基于不同熒光CDS的Fe3+檢測的比較

3 結論

本文使用杏仁為原料通過熱解-水熱法合成了N,P-CDs。制得的N,P-CDs具有水溶性高、光穩定性好、抗酸堿的性質。在水溶液中,N,P-CDs對Fe3+有很高的選擇性和靈敏度。基于N,P-CDs細胞毒性低和生物相容性好的優點,成功將其應用于細胞中Fe3+傳感和細胞多色成像。因此,我們提供了一種用廣泛易得的綠色碳源用來制備氮、磷共摻雜熒光碳點的方法,并將所制得碳點應用于生物領域。

圖8 HepG2細胞的共聚焦熒光成像(A)無Fe3+,(B)有Fe3+ (400 μmol/L)Fig.8 Laser scanning confocal microscopyimages of HepG2 cells in the absence (A)and presence (B) of Fe3+ (400 μmol/L)

圖9 (A)405 nm激發,(B)488 nm激發和(C)514 nm激發下標記有N,P-CDs的HepG2細胞的激光掃描共聚焦顯微鏡圖像;(D)A和B的合并圖像;(E)B和C的合并圖像;(F)A和C的合并圖像Fig.9 Laser scanning confocal microscopy image of HepG2 cells labelledwith the N,P-CDs under (A) 405 nm, (B) 488 nm, and (C) 514 nm excitation.(D) The merged image of A and B. (E) The merged image of B and C. (F) The merged image of A and C