姜黃素類似物A13的抗炎機制及其在SMIR術后持續性疼痛中的作用研究

俞聰聰 孔敏 吳凌智 呂揚歌

[摘要] 目的 針對本課題組活性好的姜黃素類似物A13，深入研究其抗炎機制及鎮痛作用。 方法 建立大鼠SMIR術后持續性疼痛動物模型，進行行為學測定，測定術前及術后1、3、7、12、22、32 d機械性縮足反射閾值（MWT）和熱縮足潛伏期（TWL）。提取原代腹腔巨噬細胞采用細胞NF-κB p65核轉移試劑盒進行細胞免疫熒光實驗，觀察脂多糖（LPS）誘導下A13作用后NF-κB P65核轉移情況。 結果 SMIR模型組術后1、3、7、12、22 d MWT均顯著低于術前，差異有統計學意義（P<0.05），術后12 d（7.2±0.4）下降最為明顯（P<0.05），術后32 d（13.6±0.7）接近于術前水平。與SMIR模型組比較，SMIR+A13給藥組術后1、3、7、12、22 d抑制MWT下降，MWT均顯著高于SMIR模型組同等時間點，差異有統計學意義（P<0.05），更接近于空白對照組。與Control組比較，SMIR+A13給藥組術后3、7 d兩天顯著低于Control組同等時間點，差異有統計學意義（P<0.05）。三組大鼠的TWL均無明顯改變，無顯著性差異（P>0.05）。A13能夠抑制LPS誘導下從細胞質到細胞核的p65核轉移。 結論 姜黃素類似物A13在SMIR術后持續性疼痛中對機械性痛覺具有明顯鎮痛作用，但對熱痛覺無明顯作用，其通過抑制NF-κB通路達到抗炎效果。

[關鍵詞] 脂多糖;姜黃素類似物;機械性縮足反射閾值;熱縮足潛伏期

[中圖分類號] R285.5? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）19-0025-04

Curcumin analogue A13 anti-inflammatory mechanism and its role in persistent pain after SMIR

YU Congcong1KONG Min2WU Lingzhi1LV Yang'ge1

1.Department of Pharmacy， Affiliated Hospital of Jiaxing College， Jiaxing First Hospital in Zhejiang Province， Jiaxing 314001， China;2.Department of Anesthesiology， Affiliated Hospital of Jiaxing College， Jiaxing First Hospital in Zhejiang Province， Jiaxing? ?314001， China

[Abstract] Objective To investigate the anti-inflammatory mechanism and analgesic effect of curcumin analog A13 with good activity. Methods An animal model of persistent pain after SMIR operation was established in rats， and behavioral measurements were performed to determine the mechanical withdrawal threshold （MWT） and thermal withdrawal latency （TWL） before and after 1 d， 3 d， 7 d， 12 d， 22 d， and 32 d of treatment. The primary peritoneal macrophages were extracted. The cell NF-κB p65 nuclear transfer kit was used to perform cellular immunofluorescence experiments. The nuclear transfer of NF-κB P65 after lipopolysaccharide（LPS）-induced A13 was observed. Results In the SMIR model group， the MWT at 1， 3， 7， 12， and 22 days after operation was significantly lower than that before operation， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The MWT （7.2±0.4） was decreased most obviously at the 12th day after operation（P<0.05）， and the MWT（13.6±0.7） of the 32nd day was close to the preoperative level. Compared with the SMIR model group， the SMIR+A13 administration group inhibited the decline of MWT at 1， 3， 7， 12 and 22 days after operation. The MWT in the SMIR+A13 administration group was significantly higher than that of the SMIR model group at the same time point， and the difference was statistically significant（P<0.05）， which was closer to the blank control group. Compared with the control group， the MWT of the SMIR+A13 administration group was significantly lower than that in the control group at the same time point on the 3rd and 7th days after the operation， and the difference was statistically significant（P<0.05）. There was no significant change in TWL of the three groups， and the results were not significantly different （P>0.05）. A13 can inhibit p65 nuclear transfer from cytoplasm to nucleus induced by LPS. Conclusion Curcumin analogue A13 has obvious analgesic effect on mechanical pain in persistent pain after SMIR operation， but has no obvious effect on thermal pain， which can achieve anti-inflammatory effect by inhibiting NF-κB pathway.

[Key words] Lipopolysaccharide; Curcumin analogue; Mechanical withdrawal threshold; Thermal withdrawal latency

炎癥是一種由生物或化學因素如燒傷、感染、毒素、苯酚等刺激誘導的復雜生物反應[1]。是多種疾病具有的病癥，諸多病癥均會伴有炎癥的發生。術后持續性疼痛不僅是一種傷害性感受，常還伴有炎性疼痛、神經病理性疼痛及內臟疼痛等，對患者造成極大的痛苦，嚴重影響康復和生活質量[2-4]。研究表明，姜黃素在體內和體外均有抗炎、止痛效果，但其藥動學特征極大限制了其臨床應用。以姜黃素為原料改造修飾其結構，合成姜黃素單羰基類似物A13，經活性篩選發現其有較強的抗炎藥理作用[5]。本文主要研究A13的抗炎機制及其在大鼠皮膚/肌肉切口牽拉（Skin/muscle incision and retraction，SMIR）術后持續性疼痛中的鎮痛作用。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

雄性Sprague Dawley大鼠，體重200～230 g，由南京市青龍山動物繁殖場購買，動物合格證號：SCXK（蘇）2017-0001。隨機分為空白對照（control）組、SMIR模型組、SMIR模型+A13鞘內給藥組，每組12只。SMIR模型組大鼠按Flatters法實施SMIR，SMIR模型+A13鞘內給藥組在造模前先鞘內注射A13（10 mg/kg），術后每日鞘內注射A13（10 mg/kg）一次，空白對照組不做任何處理。本研究經我院倫理委員會審核。脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）（Sigma-aldrich，USA）、細胞核轉錄因子NF-κB（Nuclear transcription factor-κB，NF-κB）p65核轉移試劑盒（上海碧云天生物技術公司）、熒光正置顯微鏡（80i，日本尼康）、von Frey纖毛刺激儀（North Coast Medical）、輻射熱痛敏刺激儀（中國浙江大學光學系研制）。A13分別與HCl 1：2制成鹽酸水溶液（A13-HCl的形式）用于一系列動物實驗中。A13溶于水中，pH調至7.26，經0.22 μm微孔濾膜過濾后再使用。A13及其氯化物的結構見圖1。

1.2 方法

1.2.1 動物造模? 大鼠采用戊巴比妥鈉（40 mg/kg，腹腔）麻醉，大腿中段隱靜脈靠里邊切開1.5～2 cm長度，在淺表肌肉上切開7～10 mm長度，放顯微牽開器的條件是可以看到內收肌群肌腱筋膜。在牽開器尖頭放到淺表肌肉下方之后，拉開肌肉可以看到內收肌群筋膜，此時，繼續拉開肌肉，在持續拉開的1 h內，對切開處注意濕度和溫度，時間滿1 h，待模型建立后，作術后處理，縫合傷口。按慣例適當進行術后抗菌藥物治療防止傷口感染。

1.2.2 檢測方法? ①行為學檢測。行為學檢測上，分別運用von Frey纖維細絲法檢測機械性縮足反射閾值（MWT），足底測痛儀足底痛覺實驗（Hargreaves法）檢測熱縮足潛伏期（TWL），前者針對機械性痛覺，后者針對熱痛覺，本研究檢測特定的7個時間點分別為術前（未造模）、術后（造模）1、3、7、12、22、32 d。②MWT值檢測。大鼠適應環境后安靜狀態下用von Frey纖維細絲刺激，在一金屬篩網上方放置一個有機玻璃箱，等大鼠在箱內適應且安靜時，連續刺激其術側后腿足下方，刺激位置位于中間，時間維持不大于4 s，若看到有抬腿或舔舐足部任一種現象，記作陽性結果。每次檢測均重復5次，有≥3次的就記作陽性結果。通過計算5次結果中記作陽性結果的百分數可以得出最大折力陽性結果百分數（用A表示），若不到3次陽性結果的，可以得出陽性結果的最少折力的陽性結果百分數（用B表示）、最大折力（用C表示）、最小折力（用D表示），計算C-[（C-D）/（A-B）] ×（A-50%）得出MWT值。③TWL值檢測。大鼠先在有機玻璃箱中適應環境后安靜狀態下用熱痛刺激儀刺激，對足下方進行照射，一直照至出現抬腿現象，得出TWL。每次檢測均重復5次，去掉最大和最小值，取平均數。

1.2.3 NF-κB p65核轉移? 提取原代腹腔巨噬細胞用滅菌水或A13（10 μM）預處理2 h，LPS（0.5 μg/mL）處理1 h后，采用細胞核轉錄因子NF-κB p65核轉移試劑盒進行細胞免疫熒光實驗，將細胞培養皿置于熒光顯微鏡下觀察各組情況。最后將紅色熒光圖和藍色熒光圖疊加起來，觀察p65核轉移情況。

1.3觀察指標

觀察并比較三組大鼠（Control組、SMIR模型組、SMIR+A13給藥組）SMIR造模前后行為學變化，包括造模前后不同時間MWT和TWL的變化;比較三組細胞（Control組、LPS組、LPS+A13組）p65核轉移情況。

1.4 統計學方法

采用SPSS19.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組內比較采用配對t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SMIR造模結果

SMIR造模成功，無神經破壞情況，且SMIR造模后大鼠無傷口化膿感染或其他不適現象。

2.2 三組大鼠SMIR造模前后行為學變化比較

2.2.1 三組大鼠SMIR造模前后不同時間MWT變化比較? SMIR模型組術后第1天即出現明顯MWT下降，術后1、3、7、12、22 d均顯著低于術前，差異有統計學意義（t=12.520、14.228、19.027、21.960、11.090，P<0.05），其中，術后12 d（7.2±0.4）下降最為明顯（t=21.960，P<0.05），術后32 d（13.6±0.7）接近于術前水平，無顯著差異（t=0.336，P=0.743），見表1、封三圖1。

SMIR模型組術后1、3、7、12、22 d均顯著低于Control組同等時間點，差異有統計學意義（t=7.553、13.539、24.828、29.297、9.862，P<0.05）。術前和術后32 d與Control組同等時間，無顯著差異（t=0.292、1.259，P=0.773、0.221），見表1、封三圖1。

與SMIR模型組比較，SMIR+A13給藥組術后1、3、7、12、22 d均顯著高于SMIR模型組同等時間點，差異有統計學意義（t=7.326、11.466、23.497、22.385、7.510，P<0.05），更接近于空白對照組。術前和術后32 d與SMIR模型組同等時間，無顯著差異（t=0.219、0.468，P=0.829、0.645），見表1、封三圖1。

與Control組比較，SMIR+A13給藥組術后3 d、7 d兩天顯著低于Control組同等時間點，差異有統計學意義（t=2.587、2.776，P<0.05）。其他時間點與Control組相比MWT無顯著差異（t=0.547、1.736、0.349、0.792、1.766，P=0.590、0.097、0.731、0.437、0.091），見表1、封三圖1。

2.2.2 三組大鼠SMIR造模前后不同時間TWL變化比較? 各組大鼠手術側足對熱刺激反應的結果顯示，SMIR造模前后不同時間，空白對照（Control）組、SMIR+A13給藥組和SMIR模型組各組的TWL均無明顯改變，三組結果無顯著性差異（P>0.05），見表2、封三圖2。

2.3 三組p65核轉移情況比較

脂多糖（LPS）可增強NF-κB p65核轉移（藍色核內的紅色部分），NF-κB的染色為紅色熒光，細胞核的熒光染料（4'，6-diamidino-2-phenylindole）（DAPI）染色為藍色熒光。LPS組紅色部分集中于核內，且顏色鮮亮，而A13預處理的細胞，LPS誘導后核轉移降低，可看出紅色部分核外偏多，核內幾乎看不到紅色，且顏色也較LPS組淡，表明A13在10 μM劑量時抑制了從細胞質到細胞核的p65核轉移。見封三圖3。

3 討論

非甾體類藥物一直以來都被用作消炎、解熱、鎮痛的藥物。然而其往往會對患者導致嚴重的副作用[6]。因此，開發一類獨特的消炎止痛藥在目前來說很有必要。

姜黃素是一種對組織損傷、炎癥、增生等具有顯著調節作用的物質[7-10]。盡管姜黃素對多種疾病均有調節作用，但其最大的局限性在于新陳代謝快、生物利用度低[11-13]。眾多手段包括合成結構相似的姜黃素衍生物等，努力朝著提高其生物利用度方向發展[14]。

A13是我們自行設計并合成的新型抗炎化合物，之前的研究已發現A13能有效抑制各種炎癥介質水平[15]。本研究通過NF-κB p65核轉移實驗，得出A13通過抑制NF-κB信號通路來達到抗炎效果。A13這種化合物被認為是一種很有前途和希望的抗炎止痛化合物。

術后疼痛是臨床上一種常見的急性疼痛狀態，困擾了諸多患者，給患者帶來了痛苦，一直以來術后疼痛是一個研究難點。SMIR造模方式已得到公認，能真切模擬臨床手術中持續拉開這個動作，且造模的同時不以破壞其他神經為代價，為研究術后鎮痛優選模型，故本研究采用SMIR模型開展研究。

本研究發現SMIR模型組術后1 d即出現明顯MWT下降，術后1、3、7、12、22 d均顯著低于術前及空白對照（Control）組同等時間點，差異有統計學意義（P<0.05），造模成功，SMIR術后大鼠產生了明顯的疼痛，且術后1 d即明顯下降，痛感敏感度較高。A13給藥組能夠明顯減少SMIR造模后MWT的變化，A13給藥組術后1、3、7、12、22 d均顯著高于SMIR模型組同等時間點，差異有統計學意義（P<0.05），術后1 d SMIR模型組MWT明顯下降，而A13給藥組MWT下降不明顯，基本接近空白對照組，在術后12 d模型組下降最明顯時，A13給藥組仍接近空白對照組，A13減少了MWT下降，故本研究得出A13對SMIR術后有較明顯的鎮痛作用，與SMIR模型組相比，A13緩解了大鼠SMIR術后產生的疼痛，使其痛感的敏感度下降。

A13給藥組是否對SMIR術后所有疼痛均有明顯作用呢？事實上A13并非作用于所有疼痛，本研究另一個行為學研究了SMIR術后TWL的變化：三組大鼠SMIR造模前后不同時間TWL均無明顯改變，三組結果無顯著性差異（P>0.05），MWT針對機械性痛覺，TWL針對熱痛覺，說明A13對SMIR術后的機械性痛覺有明顯鎮痛作用，但對熱痛無明顯作用。

針對有明顯作用的機械性痛覺，A13是否可以達到完全鎮痛效果，使給藥組大鼠在SMIR術后MWT與Control組無統計學差異呢？本研究發現SMIR+A13給藥組術后3、7 d兩天顯著低于Control組同等時間點，差異有統計學意義（P<0.05），且在術后3、7 d兩天顯著高于SMIR模型組同等時間點，差異有統計學意義（P<0.05），說明A13雖然有明顯鎮痛作用，但尚未達到完全鎮痛，術后3、7 d兩天與Control組比較有顯著性差異，A13可能只作用于疼痛機制中的某一條或幾條信號通路，并未作用于所有的信號通路[16-17]，故其鎮痛作用雖強，但尚未達到完全與Control組無差異。

有研究發現NF-κB與病理性疼痛密切相關，多種病理性疼痛模型中均存在NF-κB的激活[18]。本研究發現A13通過抑制NF-κB信號通路來達到抗炎效果，故繼續研究A13鎮痛方面的作用，結果提示A13有明顯的機械鎮痛效果，A13機械鎮痛作用與NF-κB信號通路也是相關的。

據報道姜黃素鎮痛的作用機制各不相同，其可作用于各種疼痛[19，20]。不過至今尚未達成共識，故將來會在現研究結果基礎上，深入研究姜黃素類似物A13的鎮痛機制，找出其直接作用的靶點，以實現其在臨床上安全使用。

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（收稿日期：2020-03-31）