二氫姜黃素體外處理BRL-3A細胞對細胞凋亡通路的影響*

吳 剛，陳訓軍，張萬里，李 芬

姜黃素是一種多酚類化合物，可從天南星科和姜科植物的根莖中分離得到，具有多種藥理學活性，包括保護肝臟、降脂、抗氧化、抗炎和抗腫瘤作用等，還可以通過修復線粒體功能改善(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)病變[1-3]。二氫姜黃素(dihydrocurcumin，DHC)是姜黃素代謝得到的產物之一。關于DHC的藥理學活性研究還較少，可能具有改善NASH動物肝臟脂肪沉積和胰島素抵抗作用，還可能有抗氧化和抗炎作用。 本研究觀察了DHC對棕櫚酸(palmitic acid，PA)體外誘導的正常大鼠肝細胞系BRL-3A細胞脂肪變的影響，了解其在改善線粒體介導的凋亡通路方面的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥品、試劑與儀器 正常大鼠肝細胞系BRL-3A細胞購自武漢大學菌種保藏中心，由本實驗室保存。DHC單體(上海源葉生物公司，純度≥98%)；PA和MTT(Sigma公司)；DMEM高糖培養基(Gibco公司)；胎牛血清(四季清生物公司)；胰酶(吉諾生物公司)；檢測LDH試劑盒(南京建成生物公司)；檢測Caspase-3和Caspase-9試劑盒、RIPA裂解液、SDS上樣緩沖液和化學發光液(碧云天生物公司)；檢測Annexin V-PI凋亡試劑盒(KeyGen公司)；抗β-actin、抗Bcl-2和抗Bax(Santa生物公司)；BCA試劑盒(Thermo公司)；Cocktail(Roche生物公司)。XDS-1B倒置相差顯微鏡(佳源興業科技有限公司)；iMARKTM酶標儀(BIO-RAD公司)；臺式低溫高速離心機(Eppendorf公司)；-80℃超低溫冰箱(海爾電器有限公司)；超凈工作臺(安泰空氣技術有限公司)；HEAR Cell CO2培養箱(Heraeus公司)；電泳儀、垂直電泳槽、電轉儀(六一儀器廠)；Imager2000凝膠成像分析儀(Alpha Innotech公司)。

1.2 細胞培養與分組處理 取BRL-3A細胞，接種于6孔板，培養于含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養基，37℃、5%CO2培養。設對照組，用正常培養基培養；模型組，用0.25 mM PA培養24 h和DHC處理組，先用0.25 mM PA培養24 h，再換成含16、32和64 μM DHC的培養基培養24 h。

1.3 細胞存活率檢測 將生長良好的細胞按每孔1×103個細胞接種于96孔板，待細胞貼壁后，加入0.25 mM PA培養24 h。然后，分別加入0、2、4、8、16、32、64和128 μM的DHC處理24 h。處理完成后，每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl 和PBS 180μl，于37℃反應4 h，再每孔加入DMSO 150 μl，震蕩6 min，檢測570 nm處的吸光值。

1.4 細胞培養上清LDH含量檢測 取細胞1×105個，接種于6孔板。如上處理，每孔吸取上清液20μl，按試劑說明書操作，檢測490 nm處吸光值。收集孔中細胞并裂解，檢測蛋白濃度，計算每mg蛋白中LDH 含量。

1.5 細胞凋亡檢測 接種細胞1×105個于6孔板，同上處理后，消化并收集細胞。按Annexin V-PI凋亡試劑盒說明行染色和沖洗，使用流式細胞儀檢測壞死、早期凋亡和晚期凋亡細胞數。

1.6 細胞線粒體膜電位檢測 取細胞1×105個，接種于6孔板，處理完成后用PBS洗滌，每孔加入5 μg/ml 的熒光染料JC-1 1 ml，37℃反應20 min，分別檢測激發波長525 nm/發射波長590 nm處和激發波長490 nm/發射波長530 nm處的熒光強度，其比值即為樣本的線粒體膜電位。

1.7 細胞內Caspase-3和Caspase-9活性檢測 取細胞1×105個，接種于6孔板，處理完成后消化并收集細胞，檢測蛋白濃度，計算每mg蛋白中Caspase-3和Caspase-9的相對活性。

1.8 細胞Bcl-2和Bax蛋白表達檢測 采用Western blotting法檢測，取細胞1×105個，接種于6孔板，處理完成后消化并收集細胞，用含有Cocktail和PMSF的RIPA裂解液在冰上處理細胞30 min，將得到的液體在12000 g離心10 min，取上清，獲得所需的蛋白液。按50 μg，分裝，并100℃變性10 min。用SDS-PAGE膠分離蛋白，電轉至PVDF膜上，封閉1 h，分別與特異性的一抗和二抗各孵育1 h，經化學發光液顯色，用成像儀分析結果。

2 結果

2.1 各組細胞存活率比較 0.25 mM PA及2、4、8、16、32和64 μM的DHC處理BRL-3A細胞24 h對細胞存活率無顯著影響，但128 μM的DHC處理細胞24 h能顯著抑制細胞生長，細胞存活率約為模型組的78%(P<0.05)。因此，我們選擇16、32和64 μM的DHC進行后續實驗。

2.2 各組細胞上清液生化指標比較 與對照組比較，模型組LDH水平、胞內Caspase-3和Caspase-9活性顯著升高(P<0.01)，線粒體膜電位顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，32μM DHC處理組和64μM DHC處理組LDH水平、胞內Caspase-3和Caspase-9活性明顯降低(P<0.05)，線粒體膜電位明顯升高(P<0.05，表1)。

表1 DHC和PA處理的細胞上清液生化指標比較

2.3 各組細胞凋亡情況比較 與對照組比，模型組凋亡細胞率明顯增加；與模型組比，PA處理組凋亡細胞率明顯降低(圖1)

圖1 各組細胞凋亡率比較

2.4 各組細胞Bcl-2和Bax蛋白表達量比較 與對照組比，模型組Bcl-2蛋白相對表達量降低(P<0.05)，Bax蛋白相對表達量升高(P<0.05)；與模型組比，32μM DHC處理組和64μM DHC處理組Bcl-2蛋白相對表達量升高(P<0.05)，Bax蛋白相對表達量降低(P<0.05，表2和圖2)。

表2 各組細胞Bcl-2和Bax蛋白相對表達量比較

圖2 各組BRL-3A細胞Bcl-2和Bax蛋白表達量比較

3 討論

關于NASH的流行病學研究表明，NASH患者的發病率逐年在增加，在未來十年可能成為肝移植的主要原因。因此，關于NASH的防治研究已成為研究的熱點。細胞凋亡與有絲分裂的過程在正常情況下處于平衡狀態，維持機體細胞的平衡。但在NASH模型中凋亡占主導地位，凋亡過度會進一步導致肝損傷和氧化應激紊亂等。因此，能否改善肝細胞的凋亡對于NASH的治療具有重要意義。用脂肪酸刺激肝細胞建立NASH的體外模型較為成熟，為研究藥物對NASH的作用機制奠定了良好的基礎。

在PA誘導的BRL-3A細胞，我們首先觀察到DHC對PA引起細胞LDH的釋放有緩解作用。LDH一般存在于細胞質中，當細胞膜受損的時候會被釋放到培養上清，因此培養上清LDH越多，代表細胞膜受損越嚴重[11]。我們的結果顯示DHC可以減少細胞LDH的釋放，說明DHC可以改善PA引起的細胞膜的損傷。然后，我們用流式細胞儀檢測了凋亡細胞情況，結果發現DHC可以減少由PA引起的細胞早期凋亡、晚期凋亡和壞死數量。通過這部分的研究結果，我們推測DHC可以改善脂肪變情況下的細胞凋亡。

在細胞凋亡的過程中，線粒體介導的通路是非常重要的機制之一。線粒體凋亡途徑的激活主要與過多的ROS以及氧化損傷相關，它們會破壞線粒體膜的通透性，妨礙線粒體呼吸鏈的功能，形成凋亡復合物，活化凋亡效應蛋白，加劇肝細胞的凋亡，導致肝損傷。而NASH與線粒體功能紊亂也關系十分密切。因此，我們推測DHC是否可以通過改善NASH模型線粒體介導的凋亡通路來減少細胞凋亡。

為了驗證我們的猜想，我們首先檢測了細胞線粒體膜電位的改變，結果顯示PA會顯著降低細胞線粒體的膜電位，DHC可以恢復線粒體的膜電位。線粒體的膜電位被消除，是線粒體介導的凋亡通路被激活的標志，它會導致線粒體內外膜之間的一些通道開放，引發后續凋亡事件的發生[14, 15]。這部分結果說明PA確實會激活線粒體的凋亡通路，而DHC可以抑制該通路。

Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，通過保持線粒體膜的完整性來對抗凋亡[16]。Bax是促凋亡蛋白，可以形成Bax孔道，破壞線粒體外膜的通透性，使凋亡因子釋放出來[17]。Caspase-3和Caspase-9是線粒體介導的凋亡途徑中的效應蛋白分子，它們一旦發生活化，會引起細胞DNA的斷裂、細胞核膜的裂解、核內染色質凝聚等，導致細胞凋亡[18, 19]。我們檢測了PA和DHC對這兩個酶活性的影響，結果發現PA會顯著性地增加這兩個效應酶的活性，促進細胞凋亡的過程，而DHC可以降低這兩個酶的活性，抑制細胞凋亡。