血清腫瘤特異性生長因子、miRNA-214在肝癌中的表達及對肝動脈化療栓塞術療效的預測價值

謝俊，梁先春，唐永梁

陸軍軍醫大學第三附屬醫院（野戰外科研究所）肝膽外科，重慶 400042

原發性肝細胞肝癌（primary hepatocellular carcinoma，PHC）是一類發生于肝細胞或肝內管細胞的惡性腫瘤，其發病率及病死率在所有惡性腫瘤中均排在前列[1-2]。大部分PHC患者在中晚期才被檢查發現，因此只有極少部分PHC患者能夠進行切除手術，更多的患者只能選擇肝動脈化療栓塞術（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）進行保守治療以延長生存時間[3-4]。TACE為中晚期PHC患者的主要治療方式，但依然有部分患者介入效果不佳，需要反復多次介入治療[5]，因此臨床上需要一種無創、安全評估TACE療效的方式。腫瘤特異性生長因子（tumor specific growth factor，TSGF）因為對腫瘤判斷的高靈敏度而被臨床用于評估腫瘤治療效果[6]。目前研究表明微小RNA（microRNA，miRNA）在多種惡性腫瘤中異常表達，并且與治療反應和療效預測等關系密切，miRNA-214作為miRNA家族中的成員，在多種不同組織來源腫瘤中均異常表達，在肝癌細胞中，其水平顯著降低[7]。本研究旨在探討血清中TSGF、miRNA-214水平在TACE術前術后的變化情況，并分析其水平對TACE遠期療效的預測價值，為臨床應用提供參考依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2013年1月至2015年12月陸軍軍醫大學第三附屬醫院收治的需行TACE治療的PHC患者的病歷資料。納入標準：①穿刺獲取組織并經臨床和病理學診斷確診為PHC[8]；②無法進行肝癌切除術；③甲胎蛋白≥400 μg/L；④生存時間≥3個月；⑤首次進行TACE術且無手術、化療、免疫治療及靶向治療史。排除標準：①合并嚴重心、肝、腎功能障礙；②合并其他類型惡性腫瘤；③甲胎蛋白陰性肝癌；④合并嚴重凝血功能障礙；⑤臨床資料不完整。根據納入、排除標準，共納入87例PHC患者，其中男47例，女40例；年齡（42.35±10.52）歲，中位年齡49.74歲。

1.2 TACE 治療方法及療效評價標準

保持患者臥位并選擇體右側下肢動脈作為穿刺點，進行局部麻醉后采用Seldinger技術對動脈進行穿刺，在腹腔動脈、肝動脈、腸系膜上動脈處置管進行血管造影，找到腫瘤的明確供血動脈，并對病灶數目、血供情況、有無血管侵犯及動靜脈瘺進行觀察。選取5F肝管超選擇插管至肝固有動脈，注入適量化療藥物及超液化碘油混合乳劑進行栓塞。進行肝動脈造影確定病灶處血供清況，效果滿意后拔除導管，進行常規傷口包扎，術后給予保肝、增強免疫及對癥治療。

治療期間根據影像學結果評價療效[9]，復查間隔時間為4～8周。療效評價標準：完全緩解，肝臟腫瘤完全消失且無新病灶出現；部分緩解，肝臟腫瘤最大直徑減小＞30%，且維持時間超過4周；穩定，肝臟腫瘤最大直徑減小≤30%，增大≤20%；進展，肝臟腫瘤最大直徑增大＞20%或有新的病灶出現。病情控制=完全緩解+部分緩解+穩定。

1.3 觀察指標

所有PHC患者均于TACE前1天和治療后1個月抽取外周血5 ml于抗凝管中，離心取上清后分為兩部分，一部分保存于-20℃用于TSGF測定，一部分保存于-8℃用于miRNA-214測定。TSGF測定：采用酶聯免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測定血清中TSGF水平，試劑盒購自美國Santacruz公司；實驗重復3次，取平均值作為最終檢測結果。miRNA-214測定：按照RNA提取試劑盒中說明書操作步驟提取血清中的總RNA，提取后用紫外分光光度計檢驗，光密度（optical density，OD）值（A260/A280）=1.8～2.1，并用凝膠電泳檢測RNA的完整性；符合標準后進行反轉錄cDNA合成，反轉錄體系（10 μl）：2×miRNA反應混合液5 μl，0.1%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）1 μl，miRNA Prime Script?RT酶混合物1 μl，總 RNA 0.5 μl，去 RNA 酶 ddH2O 2.5 μl；反應條件：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 s，4℃ 30 min。cDNA獲取后，進行實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測，PCR 體系（10 μl）：SYBR?Prmix Ex TapⅡ（2×）5 μl，上游引物 0.4 μl，下游引物 0.4 μl，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.2 μl，cDNA1 μl，ddH2O 3 μl，詳細操作見試劑盒說明書；PCR反應條件：50℃激活聚合酶5 min，95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火和延伸34 s，反應進行40個循環。溶解曲線繪制：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，85 ℃ 15 s，60 ℃15 s，內參基因采用β-actin。每個樣孔設置3個復孔，取 Ct平均值進行分析，以 2-△△Ct表示相對表達量。

1.4 隨訪情況

患者自治療出院后開展隨訪工作，治療后1年內每3個月門診復查1次，2年內每半年復查1次，以后至少每年復查1次，所有患者隨訪時間一致。隨訪記錄生存時間及隨訪時狀態（生存、死亡或其他）等。

1.5 統計學方法

采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；采用受試者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲線及曲線下面積（area under the curve，AUC）評價血清TSGF、miRNA-214水平對TACE療效的預測價值；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank法比較生存情況。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病情控制組和病情進展組患者臨床特征的比較

根據TACE術后療效將87例PHC患者分為病情控制組（56例）和病情進展組（31例）。病情控制組中，男性33例，女性23例；年齡37～75歲，平均（58.31±9.24）歲；巴塞羅那肝癌臨床（Barcelona clinic liver cancer，BCLC）分期：B期38例，C期18例；Child-Pugh分級：A級49例，B級7例；腫瘤主要病灶直徑5.25～10.43 cm，平均（8.94±2.61）cm。病情進展組中，男性22例，女性9例；年齡45～81歲，平均（65.47±8.68）歲；BCLC分期：B期19例，C期12例；Child-Pugh分級：A級23例，B級8例；腫瘤主要病灶直徑5.52～11.81 cm，平均（8.56±3.29）cm。

2.2 TACE 治療前后血清TSGF、miRNA-214水平的比較

TACE治療前，病情控制組與病情進展組患者TSGF、miRNA-214表達水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。TACE治療后，兩組患者TSGF表達水平均下降，miRNA-214表達水平均升高，且病情控制組患者TSGF表達水平低于病情進展組患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

表1 TACE治療前后兩組患者血清TSGF、miRNA-214水平的比較（±s）

表1 TACE治療前后兩組患者血清TSGF、miRNA-214水平的比較（±s）

注：a與本組治療前比較，P＜0.05；b與同時間病情進展組比較，P＜0.05

指標T S G F（U/m l）m i R N A-2 1 4治療前治療后治療前治療后1 8 9.2 1±1 5.1 4 1 3 4.2 6±1 0.2 6 a 0.5 6±0.1 8 1.1 4±0.2 9 a 1 7 1.5 7±1 3.5 8 9 4.2 6±1 1.3 7 a b 0.8 4±0.1 9 1.5 9±0.2 2 a時間病情進展組（n=3 1）病情控制組（n=5 6）

2.3 血清TSGF、miRNA-214表達水平預測TACE療效的ROC曲線

ROC曲線結果顯示，TSGF、miRNA-214表達水平預測TACE術后病情控制的AUC分別為0.849（95% CI=0.759～0.938）、0.807（95% CI=0.707～0.907），Cut-off值分別為181.32 U/ml、0.63。（圖1）

2.4 血清TSGF、miRNA-214表達水平與患者生存情況的關系

圖1 血清TSGF、miRNA-214水平預測TACE療效的ROC曲線

87例患者3年內死亡43例，生存率為50.57%（44/87）。根據Cut-off值將87例PHC患者分為高TSGF組（43例）、低TSGF組（44例）和miRNA-214高表達組（47例）、miRNA-214低表達組（40例）。Kaplan-Meier曲線結果顯示，低TSGF組患者的3年生存率為70.45%（31/44），高于高TSGF組的30.23%（13/43），差異有統計學意義（χ2=5.014，P=0.025）；miRNA-214高表達組患者的3年生存率為61.70%（29/47），明顯高于miRNA-214低表達組的37.50%（15/40），差異有統計學意義（χ2=6.928，P=0.008）。（圖2、圖3）

圖2 高TSGF組（n=43）及低TSGF組（n=44）患者的生存曲線

圖3 miRNA-214高表達組（n=47）及miRNA-214低表達組（n=40）患者的生存曲線

3 討論

隨著TACE技術的不斷成熟，其在臨床普及迅速，有利于中晚期PHC患者的治療，但由于單次介入治療往往無法徹底消除病灶，因此介入治療后的療效評價成為了后續治療的關鍵所在[10]。目前臨床用于評價TACE術后療效的主要方式是影像學檢查和實驗室檢查，然而影像學檢查存在一些缺陷，例如超聲檢查對于病灶較小的復發灶檢出率較低，計算機斷層掃描（CT）檢查容易混淆碘油沉積和強化的腫瘤病灶，不利于殘留病灶的判斷，磁共振成像（MRI）雖然檢出率高，但由于其檢查費用偏高，故而使用較受限[11]。實驗室檢查使用最多的是甲胎蛋白，但由于存在甲胎蛋白陰性肝癌，其對TACE術后療效的預測價值存在較多的爭議[12]。因此尋找方便、快捷的血液腫瘤標志物用于預測和評估患者的預后情況是目前肝癌研究的重點所在。

TSGF是惡性腫瘤生長及擴散過程中生成的一類生長因子，有利于促進腫瘤及周圍組織毛細血管生成及增殖，同時還會釋放上皮生長因子及干細胞生長因子等至血液中，因此血清中的TSGF水平對于腫瘤的診斷和預后有非常高的應用價值[13]。本研究結果發現，TACE治療后病情進展患者的TSGF水平高于病情控制患者，且治療后TSGF水平也降低，表明血清TSGF水平在評價TACE術后療效上具有一定的價值。馬穎等[14]研究發現，PHC患者TACE術后TSGF水平顯著降低，與本研究結果一致。既往研究認為，miRNA會被細胞外存在的RNA酶降解，但后來研究證明miRNA可以廣泛而穩定地存在于細胞外液中，因此檢測外周血中的miRNA表達情況在惡性腫瘤的診斷和防治中得到了廣泛研究[15]。有研究表明，miRNA-214在不同來源腫瘤組織中的表達存在差異，例如其在胃癌、胰腺癌中表達顯著上調，在肝細胞肝癌中顯著下調[16]。本研究結果發現，TACE治療后病情進展患者miRNA-214表達水平低于病情控制患者，術后miRNA-214水平也增高，表明血清miRNA-214表達水平在評價TACE術后療效上具有一定的價值。陳琳等[17]研究發現，胃癌患者外周血中miRNA-214表達水平顯著升高，并且miRNA-214高表達患者的預后不佳，與本研究結果相反，可能與miRNA-214的組織特異性表達相關。

本研究利用ROC曲線評估了TSGF、miRNA-214表達水平預測TACE療效的價值，發現TSGF、miRNA-214表達水平預測TACE療效的AUC值均超過了0.800，表明TSGF、miRNA-214表達水平均具有較高的預測價值，且TSGF水平為181.32 U/ml、miRNA-214表達水平為0.63的時候，約登指數最大。根據Cut-off值將患者分為高TSGF組、低TSGF組和miRNA-214高表達組、miRNA-214低表達組，Kaplan-Meier曲線結果顯示低TSGF組的3年生存率高于高TSGF組，miRNA-214高表達組的3年生存率高于miRNA-214低表達組。表明血清中TSGF、miRNA-214表達水平與患者的遠期預后關系密切。

綜上所述，TACE作為中晚期肝癌患者的主要治療手段，方便、快捷地評價TACE療效的指標對其后續治療具有積極意義，本研究結果顯示血清TSGF、miRNA-214表達水平均具有較高的預測TACE療效的價值，并且與患者遠期預后關系也較為密切，值得臨床推廣。