Gasdermin D蛋白對內毒素導致肺泡巨噬細胞焦亡的影響

帥維正 李 軍 陳旭昕 李大偉 張志成

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)的致病過程中，炎癥反應擴大和失控是其本質和進行性加重的內在原因，但其具體機制尚未完全闡明[1-4]。而在炎癥反應的發生機制中，細胞焦亡的作用越來越受到學界的重視。焦亡是一種新發現的炎癥性程序性細胞死亡，除了可以導致細胞死亡以外，它的出現通常還伴隨著炎癥因子的釋放和機體炎癥反應水平的上調[5-7]。新近研究發現GSDMD蛋白是焦亡的最終執行蛋白，同時其剪切活化也是焦亡發生的標志。雖然目前已有研究對焦亡與炎癥反應的相互關系進行了深入探索，但是尚無相關研究探討在ALI中是否存在焦亡。而肺泡巨噬細胞是肺部重要的免疫效應細胞，也是ALI研究中常用的研究對象。如果證實肺泡巨噬細胞可以發生內毒素(lipopolysaccharide, LPS)所致的焦亡，則能夠揭示焦亡參與了急性肺損傷的致病過程。

本文擬通過觀察肺泡巨噬細胞接受LPS刺激后能否出現焦亡現象，同時抑制焦亡執行蛋白GSDMD的表達作為反向驗證，以此證實GSDMD蛋白介導的炎癥細胞焦亡存在于急性肺損傷發病過程中，為進一步揭示急性肺損傷的發病機理提供新的思路。

材料與方法

一、實驗材料

所用的MH-S肺泡巨噬細胞株購自武漢賽維爾生物科技有限公司。1640培養基及PBS溶液購自美國Hyclone公司，胎牛血清(FBS)購買于美國CELLect SILVER公司，脂多糖購于美國Sigma公司，尼日利亞菌素購于中國百靈威公司，霍亂毒素B亞單位(CTB)購于中國愛必信公司，DMSO購于美國Sigma-Aldrich公司，CytoTox 96?非放射性細胞毒性檢測試劑盒購買自美國Promega公司，PI試劑盒購買于德國美天旎公司，GSDMD一抗購于美國Abcam公司，Trizol購自美國賽默飛公司，引物合成由北京諾賽公司完成，逆轉錄試劑盒及qPCR試劑盒購自南京諾唯贊公司，慢病毒干擾載體購自中國吉瑪生物有限公司。

二、實驗方法

1. 建立MH-S GSDMD蛋白低表達細胞株(KD株)： 使用小干擾RNA技術敲低MH-S細胞GSDMD蛋白表達。委托吉瑪生物有限公司進行構建LV3(H1/GFP&Puro) 病毒表達載體。

2. 焦亡誘導實驗： 將野生型MH-S細胞(WT株)、空白對照MH-S細胞(即轉染空病毒載體的NC株)和通過小干擾RNA技術敲低GSDMD蛋白表達的MH-S細胞(KD株)使用細胞計數板進行計數后，以4×105個/孔的標準接種于六孔培養皿中，每孔加入2 ml含10%胎牛血清的1640培養基。培養24 h后觀察長勢良好即予以更換無血清培養基，繼續培養12 h，如果細胞狀態正常就開始進行焦亡誘導實驗。

對每株細胞分為三組進行處理。對照組(control group)：正常培養，加入等體積PBS作為對照； LPS+尼日利亞菌素處理組(LPS+Nigericin group)：更換無血清培養基12 h后，細胞培養基中加入LPS溶液至終濃度為100 ng/ml，4 h后實驗孔加Nigericin溶液，終濃度為10 μmol/L，2 h后收取細胞。LPS+霍亂毒素B亞單位處理組(LPS+CTB group)：更換無血清培養基12 h后，細胞培養基中加入LPS溶液至終濃度為100 ng/ml，6 h后加LPS溶液至終濃度為1 μg/ml，同時加CTB溶液至終濃度為10 μg/ml，16 h后收細胞。

3. 進行RT-qPCR檢測細胞中GSDMD mRNA表達： Trizol提取RNA，使用南京諾唯贊公司逆轉錄試劑盒(HiScriptII Q RT SuperMix for qPCR)制備cDNA。諾唯贊qPCR試劑盒(AceQ qPCR SYBR Green Master Mix without ROX)參照說明書進行實時定量PCR檢測。

通過查找文獻和使用生物信息學軟件的方法以及設計相關PCR引物，GAPDH F 5′-AGCTTGTCATCAACGGGAAG-3′，R 5′-TTTGATGTTAGTGGGGTCTCG-3′；GSDMD F 5′-TGTCAACCTGTCAATCAAGGA-3′，R 5′- AGCCAAAACACTCCGGTTC-3′。

4. 提取細胞蛋白，行蛋白免疫印跡實驗： 首先提取蛋白，之后進行蛋白免疫印跡檢測。電泳、轉膜、封閉、孵育一抗和二抗。完成后發光顯影，檢測焦亡蛋白GSDMD和GSDMD-NT。使用ImageQuantTMLAS4000數字成像系統進行發光及圖像分析。

5. 乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)檢測評價細胞毒性： 按在焦亡刺激后，采用CytoTox 96?細胞毒性檢測試劑盒測定細胞上清LDH水平。細胞死亡率(%)=(實驗組OD值-陰性組OD值)/(陽性組OD值-陰性組OD值)×100%。

6. ELISA測定細胞上清中白介素-1β(interleukin -1β, IL-1β)水平： ELISA相關檢測使用杭州聯科生物技術股份有限公司提供小鼠IL-1β ELISA檢測試劑盒。嚴格按照試劑盒說明書進行實施操作，設置3個復孔。

7. PI免疫熒光檢測： 24孔板培養細胞，細胞密度為1×105/孔。使用焦亡刺激物處理后，吸出上清，1 ml PBS輕輕漂洗一次，吸出。使用1 ml binding buffer 輕輕漂洗后吸出，再次加入500 μl binding buffer。加入5 μl PI，立即在熒光顯微鏡下觀察。每次實驗孔隨機選擇5個高倍視野，統計其中細胞總數和PI陽性細胞數后計算PI陽性百分比。

三、統計學方法

結 果

一、焦亡刺激后GSDMD mRNA表達

無焦亡刺激物處理、LPS+CTB、LPS+NIG情況下KD組的目的蛋白mRNA表達量分別為0.19±0.02%和0.38±0.01，均低于WT組和NC組(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組MH-S細胞GSDMD mRNA表達；注：*與相同處理條件下WT組相比，P<0.05；#與相同處理條件下NC組相比，P<0.05

二、GSDMD-NT表達

使用Western Bloting檢測WT、NC、KD細胞株在接受焦亡刺激后的GSDMD-NT蛋白水平的表達。結果可見，接受LPS+CTB干預的情況下KD組(0.14±0.06)的激活狀態的GSDMD蛋白N端片段表達量均低于WT組和NC組(0.26±0.05，0.27±0.04，P<0.05)。而經過LPS+NIG進行焦亡刺激后，KD組(0.38±0.01)的目的蛋白表達量也均低于WT組和NC組(1.04±0.04，1.01±0.03，P<0.05)，見圖2、3。

圖2 對照組及焦亡刺激物處理后各組MH-S細胞GSDMD-NT蛋白表達

三、MH-S細胞死亡率及炎癥因子釋放水平

各組細胞接受焦亡誘導物刺激后，LDH水平均明顯升高，而接受GSDMD表達敲低的細胞株(KD組)其LDH水平顯著低于野生組(WT組)和空白載體組(NC組)(P<0.05)。在焦亡誘導下3組細胞上清中IL-1β水平均較對照組明顯上升。KD組(1 184.56±36.98)細胞接受LPS+CTB刺激后，其培養基上清中IL-1β水平明顯低于WT組(2 374.00±72.11)和NC組(2 655.67±88.14)(P<0.01)。KD組(1 870.11±170.07)細胞接受LPS+nigericin刺激后，其培養基上清中IL-1β水平明顯低于WT組(4 257.33±117.80)和NC組(3 883.44±106.06)(P<0.01)，見表1。

腦梗死形成的主要原因包括有動脈管壁病損、血流動力學出現異常、血液成分改變等,血液粘滯性高,是腦梗死的主要危險因素[1]。彩色多普勒超聲和頸動脈血管超聲在臨床中為常用的影像學診斷方式,本次主要探究彩色多普勒超聲+頸動脈血管超聲聯合在診斷中的應用價值,研究如下:

表1 焦亡刺激物處理后MH-S細胞死亡率及炎癥因子釋放水平

四、細胞PI染色比例

使用鏡下觀察細胞PI染色的方法來判斷細胞死亡情況，見圖4，接受LPS+CTB處理后，KD組(18.33±0.76%)PI染色陽性細胞比例明顯低于WT組和NC組(28.70±1.05%，34.53±3.86%，P<0.05)。LPS+nigericin處理后，KD組(26.4±1.31%)中PI染色陽性百分比明顯少于WT和NC組(61.03±2.37%，66.27±2.72%，P<0.05)。

圖4 不同焦亡刺激物處理后MH-S細胞的PI染色陽性百分率；注：*與相同處理條件下WT組相比，P<0.05；#與相同處理條件下NC組相比，P<0.05；

討 論

骨髓來源巨噬細胞和腹腔巨噬細胞均可發生焦亡并引起炎癥因子釋放，但尚無肺泡巨噬細胞經GSDMD蛋白執行焦亡過程的相關研究[8-12]。本文對LPS能否誘導肺泡巨噬細胞焦亡進行了探討，并觀察了GSDMD蛋白在其中所起的作用。

細胞焦亡這一概念由 Cookson于2001年首次提出，用于定義一種新發現的炎癥性的程序性細胞死亡[13]。這種細胞死亡依賴于Caspase-1的激活，并且其同時具有凋亡和壞死的部分特征性變化[14-16]。由于焦亡是炎癥壞死性的細胞程序性死亡，因此它的出現通常還伴隨著炎癥因子的釋放和機體炎癥反應的上調，而IL-1和IL-18的大量釋放，也標志著炎癥小體的激活[17]。

目前學界已有共識，急性肺損傷的本質是炎癥反應的失控。而自細胞焦亡現象被發現以來，其在急性肺損傷中的作用越來越受到研究者的關注[18-19]。研究發現以Caspase-1為代表的炎癥小體活化參與了ARDS的發病過程。而LPS介導的焦亡激活除了Caspase-1介導的經典途徑以外，還存在著非經典途徑，即進入胞質的 LPS直接激活人體細胞內的Caspase-4/5或者小鼠體內的Caspase-11而介導細胞焦亡[20-21]。

本文使用了LPS+nigericin和LPS+CTB兩種焦亡刺激物組合處理肺泡巨噬細胞，其分別代表了LPS通過經典途徑和非經典途徑誘導細胞出現焦亡的過程。從實驗結果可知，MH-S細胞在接受刺激后出現了細胞上清中LDH和IL-1β水平上升，PI染色陽性細胞比例增加以及焦亡標志物蛋白GSDMD-NT的表達，這些證據證實了肺泡巨噬細胞可以被LPS誘導出現焦亡，并且在這一過程中經典途徑和非經典途徑均可激活。

在針對目的蛋白表達的WB檢測中，無論是經典通路還是非經典通路的刺激物處理后，KD組的GSDMD活化產物即GSDMD-NT的表達量同樣是低于WT組和NC組細胞，說明通過RNA干擾敲低GSDMD蛋白表達后，在降低原型蛋白的合成表達水平的同時，其活化產物的水平同樣受到抑制。

而伴隨著GSDMD-NT表達量的降低，細胞死亡率也出現了明顯下降。通過對細胞上清的LDH測定，無論是經典焦亡通路的LPS+nigericin處理還是非經典通路的LPS+CTB干預后，相較于WT組和NC組細胞，KD組細胞的上清中乳酸脫氫酶水平更低，這也提示了KD組的細胞膜損傷更小而細胞死亡率也更低。同樣，在PI染色的檢測結果中也觀察到了類似的情況。這一結果與相關文獻報道中其他種類細胞GSDMD蛋白低表達引起細胞焦亡水平受到抑制的現象是相近的[22-25]。推測其原因很可能是由于活化的GSDMD-NT表達量降低后，其在細胞膜上形成多聚體小孔而導致細胞膜通透性異常的現象隨之減少，細胞死亡率也隨之下降。但由于目前尚無對GSDMD-NT所致細胞膜小孔密度評價的方法，這一推論尚無法證實。

IL-1β作為重要的促炎癥因子，同時也是焦亡發生時常常伴隨出現的細胞因子，其分泌水平的上調，一方面提示了焦亡現象的出現，另一方面也說明炎癥反應水平的升高。本文中，在GSDMD-NT表達量降低的KD細胞組，其炎癥因子IL-1β的分泌水平也更低，這一結果也與目前國外研究結論相一致。

本文中，肺內巨噬細胞GSDMD蛋白和其剪切體表達的降低，導致細胞死亡減少同時抑制了IL-1β的分泌，說明可以通過降低免疫細胞活化水平和細胞因子釋放降低機體炎癥反應水平，如果對其進行干預可能可以起到阻斷ALI的炎癥反應級聯擴大和失衡的作用，減輕肺部損傷。但這一設想還有待于下一步進行體內動物實驗驗證。

綜上所述，下調MH-S細胞GSDMD蛋白表達可以起到抑制LPS導致的MH-S細胞焦亡和IL-1β分泌釋放的作用。