基于深度學習的HER-2免疫組化自動判讀模型

范盈盈，向旭輝，雷 婷，周燕燕，步 宏,，鄭眾喜

乳腺癌是常見的惡性腫瘤之一，人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor 2, HER-2)基因擴增可見于15%～20%的乳腺癌，HER-2陽性與乳腺癌患者不良預后相關[1]。目前最常用的HER-2檢測方法為免疫組化，但是該方法受病理醫師的經驗及主觀差異的影響，不同實驗室間HER-2判讀的一致性及可重復性差異顯著[2]。計算機在圖像處理方面具有優越性，因此被用于提高HER-2免疫組化判讀的準確性及可重復性。傳統機器算法的性能較大程度上依賴于特征提取選擇，而特征提取選擇存在差異，并且傳統的機器算法不能支持大量數據的研究[3]，而深度學習在病理圖像上表現出較高的準確性及實用性，因此目前逐漸取代傳統的計算機算法應用于病理圖像處理中[4-5]。

回顧相關文獻，大部分已發表的研究僅對感興趣區域進行分析，導致最終準確性變化大[6-7]。因此在本實驗中使用深度學習算法建立準確性高、基于全片腫瘤區域的HER-2免疫組化的自動判讀模型，并且對該模型性能及其臨床應用的可行性進行分析。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2018年1月～2019年8月四川大學華西醫院存檔的浸潤性導管癌手術切除標本215例。患者臨床病理資料均直接取自本院的臨床病歷資料或者病理資料，包括患者年齡、性別、腫瘤直徑、病理學分級等。

1.2 方法標本均經10%中性福爾馬林固定，常規行脫水及石蠟包埋，4 μm厚連續切片，行HE和免疫組化染色。免疫組化染色使用羅氏Ventana全自動免疫組化染色儀，以DAB顯色、蘇木精對比染色。使用羅氏公司克隆號為4B5的兔抗人HER-2單克隆抗體為一抗，操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

1.3 判讀標準HER-2免疫組化判讀以《乳腺癌HER-2檢測指南(2019)》[8]為標準，即：無著色或≤10%的浸潤癌細胞呈不完整的、微弱的細胞膜染色為(0)；>10%的浸潤癌細胞呈不完整、微弱的細胞膜染色為(1+)；>10%浸潤癌細胞呈弱～中等強度的完整細胞膜染色或者≤10%的浸潤癌細胞呈完整、強且均勻的細胞膜染色為HER-2(2+)；>10%的浸潤癌細胞呈完整、強且均勻的細胞膜染色為HER-2(3+)。HER-2(0～1+)為陰性，HER-2(2+)為不確定，HER-2(3+)為陽性。

1.4 HER-2自動評分模型HER-2免疫組化切片使用優納公司數字病理切片掃描儀進行全片掃描，形成全載玻片成像(whole slide imaging, WSI)。選取15例WSI作為訓練數據，200例WSI作為測試數據。15張WSI中的感興趣區域(即浸潤性導管癌)在物鏡10×下進行不重疊地分割，分割為32×32像素大小，由病理醫師對每張分割圖片進行分類。每張分割圖片分為0及1+、2+、3+、其它四類。其中其它分類用以區分腫瘤組織與非腫瘤組織，包括：背景(沒有確切的細胞核)、壞死區域、正常乳腺組織、間質及異常著色區域。訓練數據中用于圖片特征學習的訓練集分割圖片合計12 550張：0及1+為2 226張，2+為2 074張，3+為2 124張，其它為6 126張。訓練數據中用于模型選取的驗證集包含2 013張圖片：0及1+為428張，2+為298張，3+為449張，其它為838張。

基于Inception V3和Resnet網絡建立深度學習網絡。深度學習模型實現HER-2免疫組化的自動評分主要由兩部分構成，即分割圖片分類及HER-2評分(圖1)。分割圖片分類步驟中將WSI分割為32×32像素大小的圖片。將分割圖片輸入到深度學習模型中，模型對每張分割圖片進行分類判讀。HER-2評分步驟中將分割圖片的判讀結果進行信息整合，最后計算判讀為0及1+、2+及3+分類的分割圖片百分比，對全片HER-2免疫組化圖像進行判讀。200例測試集數據均由3名經驗豐富的病理醫師進行獨立判讀，共同的判讀結果作為標準判讀。第4名病理醫師獨立于3名病理醫師進行判讀。

1.5 統計學方法采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，計數資料采用Pearson χ2檢驗，評估兩種檢測方法之間的一致性采用Kappa值。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床特點患者平均年齡為52.9歲，腫塊平均直徑為2.5 cm，病理組織學分級：WHO Ⅰ級2例，WHO Ⅱ級95例，WHO Ⅲ級118例，患者均為女性，均為手術切除標本。

2.2 HER-2免疫組化染色結果判讀實驗納入陰性病例HER-2(0及1+)130例(60.5%)，不確定病例HER-2(2+)42例(19.5%)，陽性病例HER-2(3+)43例(20%)。WSI中深度學習模型判讀為0及1+、2+、3+、其它四類的分割圖片如圖2所示。200例測試集中深度學習模型及病理醫師判讀結果中陰性病例分別為101例(50.5%)及92例(46%)，不確定病例為56例(28%)及68例(34%)，陽性病例為43例(21.5%)及40例(20%)。深度學習模型判讀結果見表1。深度學習模型判讀的準確率為87.5%(75/200)，病理醫師判讀的準確率為81.5%(163/200)，深度學習模型判讀的準確率高于病理醫師的判讀準確率(P<0.05)。深度學習模型判讀結果與標準判讀之間的Kappa值為0.79(P<0.05)，病理醫師判讀結果與標準判讀之間Kappa值為0.71(P<0.05)，深度學習模型判讀結果與病理醫師判讀結果之間的Kappa值為0.70(P<0.05)，深度學習模型判讀結果與標準判讀及病理醫師判讀結果之間的一致性較高。深度學習模型與病理醫師在不確定病例中判讀的準確率分別為60.7%(34/56)及50%(34/68)，兩者差異無統計學意義(P=0.23)。與病理醫師判讀相比，深度學習模型減少17.6%(12/68)的不確定病例。

圖1 HER-2免疫組化自動判讀模型判讀流程

圖2 感興趣區域進行分割后的圖片：A.0；B.1+；C.2+；D.3+；E.其它，異常著色區域；F.其它，背景沒有確切的細胞核

表1 深度學習模型判讀結果

2.3 評判不一致病例深度學習模型判讀與標準判讀間有25例判讀不一致病例，深度學習模型將22例陰性病例判讀為不確定，3例不確定病例判讀為陽性，假陽性率為1.5%(3/200)。病理醫師判讀的假陽性率及假陰性率分別為0.5%(1/200)及1%(2/200)。25例判讀不一致的病例中，病理醫師判讀與標準判讀的一致性僅為52%；而在判讀一致的175例中，病理醫師判讀與標準判讀之間的一致性為85.7%，兩者差異有統計學意義(P<0.05)。深度學習模型判讀與標準判讀之間判讀不一致的病例中13例為HER-2異質性表達，2例為組織重疊，1例在腫瘤周圍及腫瘤組織中存在術中定位墨汁。

3 討論

本實驗提出的HER-2免疫組化自動判讀模型，是在分割圖片分類的基礎上進行全片腫瘤細胞HER-2免疫組化判讀。目前發表的相關研究中，大部分研究是基于感興趣區域進行HER-2免疫組化判讀，該方法通常受感興趣區域數量、非腫瘤區域的面積以及選擇者之間主觀差異的影響，最終的HER-2免疫組化判讀的準確性變化大，準確性為78%～98.33%[6-7,9]。與這些研究相比本組實驗提出的方法實現了HER-2免疫組化全片腫瘤區域的判讀，避免了由感興趣區域以及選擇者間主觀差異對HER-2免疫組化判讀的影響，與病理醫師實際工作中基于全片的HER-2免疫組化判讀方法一致。

Khameneh等[10]為了實現全片腫瘤區域腫瘤細胞的細胞核、膜的分割識別，采用包括支持向量機(support vector machine, SVM)、局部二值模式(local binary patterns， LBP)及顏色直方圖等算法提取圖像特征，區分上皮及非上皮成分。本實驗中將間質成分、正常的乳腺組織及異常著色等非腫瘤區域的分割圖片歸到一個類別中，標記工作簡單，避免由傳統算法中手動提取特征過程中導致的圖像數據的流失及選擇偏移。值得一提的是Vandenberghe等[11]對全片中免疫細胞、基質細胞、人工假象及不同分級的腫瘤細胞進行探測分類，這種方法在標注過程中易受標注者間的主觀差異影響，這可能是導致其結果準確性不高的原因。

本實驗的準確性為87.5%，低于部分目前已經發表的研究(表2)。除了與WSI全片判讀的方法相關外，可能與計算方法相關。依據已發表文獻準確率的計算方法，去除本實驗中1.5%的假陽性率，98.5%的準確率高于目前已發表的相關研究。本實驗中提出的HER-2免疫組化自動評分模型的準確率高，能準確識別出陰性病例，無假陰性病例，在臨床病理診斷工作中能在一定程度上減輕病理醫師的工作負荷。

本實驗中HER-2免疫組化自動判讀模型與標準判讀一致的病例中與病理醫師的判讀一致性明顯高于與評讀不一致的病例，提示深度學習模型能識別部分易于誤判的病例，可以幫助病理醫師識別高風險病例提高判讀的準確性，與Vandenberghe等[11]的結論相似。

HER-2 (2+)病例及HER-2表達異質性病例是日常病理診斷工作的難點[12-13]。本實驗的深度學習模型能在保持與病理醫師判讀相同準確性的同時，能減少17.6%判讀為HER-2 (2+)的病例。深度學習模型判讀不一致的病例中超過50%的病例具有HER-2表達異質性，是影響深度學習模型準確性的主要因素，因此這部分病例的判讀結果需要病理醫師進行復核判讀。

表2 已發表的使用深度學習HER-2免疫組化評估研究

總之，本實驗提出的深度學習模型是在進行簡單標記的測試集數據上進行模型的建立，在此基礎上建立了準確性高的HER-2免疫組化全片自動判讀模型。該模型能識別明確的陰性病例，幫助病理醫師識別高風險病例，減少判讀為HER-2 (2+)病例的數量，提高病理醫師判讀的準確性及一致性。深度學習模型在一定程度上能減少病理醫師的工作負荷，為乳腺癌患者臨床治療方案的決策及預后提供更準確的信息。