皺皮木瓜種質藥用成分含量及性狀變異研究

馬凱旋,沈汝波,豐 震,任紅劍,孔 青,于 曉,劉國興,王 利**

1.山東農業大學黃河下游森林培育國家林業與草原局重點實驗室,山東 泰安 271018

2.山東臨朐縣果樹站,山東 臨朐 262600

3.山東寧陽縣林業局,山東 寧陽 271400

4.山東醫藥技師學院泰山食品藥品檢測中心,山東 泰安 271016

我國是皺皮木瓜（Chaenomeles speciosa）的起源分布中心，主要分布于安徽、山東、湖北、貴州、四川、重慶等地[1]。皺皮木瓜為薔薇科落葉灌木，枝具刺，花簇生，其適生于溫帶、亞熱帶氣候區，適應性強，微酸、微堿性土壤均能適應[2]。其果實干燥后果皮皺縮，臨床用以治療吐瀉轉筋、濕痹、腳氣、水腫、痢疾及維生素C 缺乏癥等疾病[3]，具有保肝、驅風除濕、舒筋活絡、抗炎鎮痛、消腫等功效，它是保健食品和中藥的重要來源[4]。前人研究表明礦質元素參與植物有機體代謝和調節機體酶活性，是果實生長發育、產量形成和品質提高的物質基礎[5]。

皺皮木瓜具有豐富的藥用、營養價值，齊墩果酸和熊果酸是皺皮木瓜的主要藥效成分[6]，兩者對木瓜資源的開發具有特別重要的意義。結合皺皮木瓜中微量元素的含量，探究其之間的相關性，對指導皺皮木瓜提高藥用價值具有重要的理論價值和實踐意義。目前關于皺皮木瓜中齊墩果酸、熊果酸與微量元素之間的相關性分析鮮見報道。本文以山東臨沂14 株不同單株的皺皮木瓜為試材，測定其果實齊墩果酸、熊果酸含量以及鈣、鎂、鋅等6 種微量元素的含量，分析齊墩果酸、熊果酸和微量元素之間相關關系，為藥用皺皮木瓜種質資源育種與栽培提供理論基礎和技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料14 株皺皮木瓜采自于山東省臨沂市木瓜藥材基地，其樹齡均為8 年。取其果實自然風干后放入55 ℃恒溫烘箱烘干，粉碎后過篩備用。

1.2 儀器與試劑

Agilent 1260 高效液相色譜儀，KB-500DB 型數控超聲波清洗器，電子天平（型號BT125D），電子天平（ME204），高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀有限公司），TAS-990 型原子吸收分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；Zn、Fe、Mn、Cu、Ca、Mg 空心陰極燈(北京普析通用儀器有限責任公司)；對照品齊墩果酸（0709-9803）來源于中國藥品生物制品檢定所，對照品熊果酸（110742-201421）來源于中國食品藥品檢定研究院，其純度均大于93.8%。

1.3 齊墩果酸及熊果酸提取及含量測定

1.3.1 色譜條件 在齊紅[7]等人的試驗方法上進行了改進，采用超聲提取，HPLC 測定。色譜柱Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5 μm) SN：02863428 013841；流動相：甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（265：5：0.1：0.05）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：210 nm；柱溫：18 ℃；進樣量20 μL。

1.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取齊墩果酸對照品、熊果酸對照品0.01179 g、0.02023 g 分別置10 mL棕色量瓶中，加甲醇制成1.179 mg/mL 齊墩果酸的對照品溶液和含1.898 mg 熊果酸的對照品溶液。分別精密量取齊墩果酸對照液1 mL、熊果酸對照液0.5 mL 置于10 mL 棕色量瓶中，加甲醇制成mL各含0.1179 mg/mL、0.0949 mg/mL 的混合液1。分別精密量取齊墩果酸對照液1 mL、熊果酸對照液0.5 mL 置于50 mL 棕色量瓶中，加甲醇制成0.02358 mg/mL、0.01898 mg/mL 的混合液2。

1.3.3 供試品溶液的制備 取本品細粉約0.4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）20 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

1.3.4 峰面積計算 齊墩果酸、熊果酸含量均由標準品的峰面積計算得出，其計算公式為：

AX：供試品峰面積；CX：供試品濃度；AR：對照品峰面積；CR：對照品濃度。

1.4 微量元素提取及含量測定

1.4.1 樣品處理 利用火焰原子吸收法測定Zn、Fe、Mn、Cu、Ca、Mg 六種微量元素含量[8]。準確稱取皺皮木瓜粉末0.1 g，置于100 mL 的消化管中，先用水潤濕樣品，然后加5 mL 濃硫酸，輕輕搖勻、放置過夜，在消化爐上先低溫緩緩加熱，當溶液全部呈棕黑色時，從消化爐上取下消化管，稍冷，逐滴加入300 g/L H2O210 滴，并不斷搖動消化管使其充分反應。加熱至微沸10～20 min，再加入H2O25～10 滴。如此反復2～3 次，直至消煮液呈無色或清亮色后，再加熱5～10 min，已除盡過剩的雙氧水。取出消煮管冷卻，用定性濾紙過濾到15 mL 離心管中并定容，供待測。

1.4.2 標準曲線（見表1）

1.5 數據處理與分析

利用SPSS 22.0、Excel2003 軟件對數據進行統計分析和作圖；用方差分析比較各藥用成分之間的差異；對齊墩果酸、熊果酸與微量元素之間進行相關性分析及主成分分析。

表1 六種微量元素測定時的回歸方程及相關系數Table 1 Regression equations and correlation coefficients for determination of six trace elements

2 結果與分析

2.1 皺皮木瓜果實齊墩果酸、熊果酸含量的變化

測定結果表明，不同種質間的齊墩果酸的含量普遍高于熊果酸的含量。各種質間齊墩果酸的含量差異較大，變異系數為44.30%，平均值為5.220 mg·g-1，種質M13含量最高8.024 mg·g-1，M8最低1.568 mg·g-1。熊果酸含量相對差異較小，變異系數為28.67%，平均值為1.476 mg·g-1，M2種質含量最高1.987 mg·g-1，M1種質最低0.580 mg·g-1。齊墩果酸和熊果酸含量之和最高（9.822 mg·g-1）的種質是M13，最低的是M6(2.588 mg·g-1)。

表2 皺皮木瓜果實齊墩果酸、熊果酸的含量（mg·g-1）Table 2 The contents of oleanolic acid and ursolic acid in fruit of Chaenomeles speciosa

2.2 皺皮木瓜果實微量元素含量的分析

表3 皺皮木瓜種質中微量元素含量（μg·g-1）Table 3 Contents of trace elements in Chaenomeles speciosa

由表3 可見，14 個種質都含有大量人體必需的微量元素，其中Ca 元素的含量最高，遠高于其它元素。Mg 元素也相對較高，Fe、Mn、Zn 次之，Cu 含量最低。Ca 元素含量最高的種質是M4，高達1606.80 μg·g-1；Mg 元素含量最高的種質是M2，含量為388.60 μg·g-1。不同種質間微量元素含量差異明顯，Fe 元素的變異系數為28.26%，最高含量為230.65 μg·g-1，最低含量為93.75 μg·g-1；Zn的變異系數為27.12%，最高含量大約是最低含量的兩倍。

2.3 皺皮木瓜果實的微量元素與齊墩果酸、熊果酸相關性分析

皺皮木瓜果實齊墩果酸、熊果酸與6 種微量元素之間的相關性分析結果表明(表4)，齊墩果酸的含量與Fe 元素含量呈極顯著負相關，相關系數是-0.881；與Ca 元素含量成顯著負相關，相關系數是-0.579；與Zn、Mn、Cu、Mg 元素含量都成負相關。熊果酸的含量與Zn 元素呈顯著負相關，相關系數是-0.555；與Fe、Cu 元素成負相關，與Mn、Ca、Mg 元素成正相關；這表明通過測皺皮木瓜中這六種微量元素的含量，可推測出其中齊墩果酸、熊果酸含量的高低，為篩選優質木瓜資源提供一定的科學依據。同時6 種藥用成分之間存在一定的相關性，Fe 元素與Zn 元素、Mg 元素與Ca 元素都成極顯著正相關性；齊墩果酸與熊果酸之間相關性并不顯著。

表4 皺皮木瓜果實的微量元素與齊墩果酸、熊果酸的相關性Table 4 Correlations between trace elements and oleanolic acid,ursolic acid in fruit of Chaenomeles speciosa

2.4 皺皮木瓜種質性狀變異的主成分分析

皺皮木瓜種源藥用成分變異的第1、第2 主成分和第3 主成分的貢獻率分別為36.547%、27.985%和14.776%；在第1 主成分分析中Fe 元素特征值較大，為0.552，即Fe 元素占主導地位，故可以稱第1 主成分為Fe 元素因子。在第2 主成分中，Ca 的特征值達到0.623，表明皺皮木瓜藥用品質受Ca 元素的影響較大，故可以稱第2 主成分為Ca 元素。在第1、2 主成分中，齊墩果酸的特征值也相對較高，在皺皮木瓜藥用品質評價中可作為重要性狀。在第2 主成分中，熊果酸特征向量較大(0.717)，故稱第3 主成分是熊果酸元素(表5)。前2 個主成分累計貢獻率僅為64.532%，前3 個主成分累計貢獻率為79.308%，表明各性狀指標的累計貢獻率增長較慢，木瓜種質資源具有較大的遺傳多樣性。

表5 皺皮木瓜種質性狀變異的主成分分析結果Table 5 Results of principal component analysis of character variation in germplasms of Chaenomeles speciosa

3 結論與討論

皺皮木瓜果實的微量元素和藥用成分變異豐富，即使來自同一環境的不同種質也存在顯著變異，果實中齊墩果酸、熊果酸含量豐富[9]，二者都是其果實中重要的三萜類化合物，藥理研究表明，它們具有一定的保肝作用[10]。張玲等[11]曾用HPLC 法測定了不同品種木瓜中齊墩果酸和熊果酸的含量，結果顯示皺皮木瓜中齊墩果酸和熊果酸含量最高；齊紅等[7]運用HPLC 轉換波長法測得皺皮木瓜齊墩果酸含量范圍為2.805 mg·g-1～16.445 mg·g-1，熊果酸含量范圍2.514 mg·g-1～9.041 mg·g-1。他們的研究結果與本研究有所不同，這可能由于試材的基因型差異，以及與試驗環境、采集時間等因素有關。

本研究揭示了皺皮木瓜中齊墩果酸、熊果酸與6 種微量元素的含量呈一定的相關性。但是有關植物間藥用成分與微量元素之間相關性的研究較少，其中羅敏等人[12]對皺皮木瓜中齊墩果酸、熊果酸的含量與土壤理化性質進行了相關性分析，結果表明皺皮木瓜中熊果酸受土壤理化性質的影響最大。土壤因素等影響植物葉片、果實等品質；因此根據植物果實中藥用成分或者土壤中微量元素含量，可大致推斷其產量的高低[13-16]。其次在植物的同一器官中進行有關元素含量和藥用成分的研究較少，該實驗結果揭示了皺皮木瓜果實中微量元素和藥用成分的相關性。在以后育種工作當中，可通過間接輔助育種，適當控制Fe、Zn 等微量元素的含量，以增加齊墩果酸或綠原酸等有益酸的含量；另外，因藥用成分檢測成本較高，操作復雜，而檢測微量元素的方法和技術，簡單易操作，這大大提高了選擇育種的效率。

通過研究植物的主要性狀，由不同品系或單株試材的各性狀指標進行主成分分析，所得到的結果為該類植物種質資源評價提供重要依據[17,18]。本研究根據皺皮木瓜種質性狀變異的主成分分析結果，得到影響皺皮木瓜種源藥用變異情況的第1、2 主成分和第3 主成分分別是Fe 元素因子、Ca 元素因子和熊果酸因子，其研究結果對皺皮木瓜種質資源評價具有重要的意義。

皺皮木瓜作為重要的藥用植物，藥用成分含量豐富，尤其以種質M11和M13為代表，它們不僅齊墩果酸和熊果酸含量高，而且和其他種質相比其Ca 元素更是豐富，分別高達1050.20 μg·g-1，1108.10 μg·g-1，可作為優質藥用皺皮木瓜新種質。盡管本研究闡明了不同種質間藥用成分及微量元素的相關關系，對今后藥用皺皮木瓜的種質選擇具有重要的價值。但是，畢竟受研究時間的限制，測定的種質數量和成分種類偏少，為了更加深入了解皺皮木瓜種質間的藥用成分關系，篩選出更多的優良新種質，需要結合其他試驗，更加全面系統地進行研究和分析。