高效液相色譜法測(cè)定食用檳榔中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的不確定度評(píng)定

袁 河 肖曉義, -, 劉 佳 趙志友 - 夏延斌 -

(1. 湖南省檳榔加工與食用安全工程技術(shù)研究中心，湖南 湘潭 411100；2. 湖南賓之郎食品科技有限公司檢測(cè)中心，湖南 湘潭 411100；3. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

檳榔是棕櫚科植物檳榔干燥成熟種子，含有人體所需的生物堿、多酚、氨基酸以及不飽和脂肪酸等多種營(yíng)養(yǎng)成分和活性成分[1]。檳榔主要種植在中國(guó)的海南和臺(tái)灣，海南95%以上的檳榔以干果的形式直接銷(xiāo)往湖南加工成食用檳榔(亦稱(chēng)檳榔嚼塊)[2]。食用檳榔在加工過(guò)程中，為了保證食用檳榔的安全性和可口性，根據(jù)GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》，食用檳榔添加量適用于話化類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，山梨酸和苯甲酸最大添加量不得超過(guò)0.5 g/kg，糖精鈉最大添加量不得超過(guò)5 g/kg。因此如何客觀準(zhǔn)確地測(cè)量其含量對(duì)企業(yè)防腐劑的添加具有指導(dǎo)作用，而檳榔成分復(fù)雜且加工時(shí)會(huì)添加數(shù)十種添加劑，增加了準(zhǔn)確測(cè)量的難度?，F(xiàn)有研究[3-4]多是檢測(cè)檳榔中多種食品添加劑的含量，并未對(duì)其不確定進(jìn)行評(píng)定。

為了能夠直觀反映各個(gè)分量對(duì)測(cè)量結(jié)果的分散性，試驗(yàn)擬依據(jù)GB 5009.28—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定》開(kāi)展試驗(yàn)，依據(jù)不確定度評(píng)定的相關(guān)準(zhǔn)則[5-6]，建立模型，對(duì)整個(gè)操作過(guò)程中產(chǎn)生不確定度進(jìn)行分析得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

1 材料與方法

1.1 試劑、儀器及材料

乙酸銨：分析純，湖南匯虹試劑有限公司；

甲醇：色譜純，美國(guó)天地(TEDIA)試劑公司；

高效液相色譜儀：LC-20A型，配DAD檢測(cè)器，株式會(huì)社島津制作所；

超聲波清洗機(jī)：型號(hào)KQ-700E，昆山美美超聲儀器有限公司；

分析天平：型號(hào)EX125DZH，奧豪斯儀器(常州)有限公司；

賓之郎爆珠檳榔：市售；

苯甲酸(CAS號(hào)：65-85-0)：99.0%，中國(guó)食品藥品檢定研究院；

山梨酸(CAS號(hào)：110-44-1)：99.8%，中國(guó)食品藥品檢定研究院；

糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)品(CAS號(hào)：128-44-9)：99.9%，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.2 試驗(yàn)過(guò)程

采用GB 5009.28—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定》中第一法(高效液相色譜法)對(duì)食用檳榔中苯甲酸、山梨酸及糖精鈉含量進(jìn)行測(cè)定。

準(zhǔn)確稱(chēng)取約2 g(精確到0.001 g)試樣于50 mL具塞離心管中，加水約25 mL，渦旋混勻，于50 ℃水浴超聲20 min，冷卻至室溫后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，于殘?jiān)屑铀?0 mL，渦旋混勻后超聲5 min，于8 000 r/min離心5 min，將溶液轉(zhuǎn)移到同一容量瓶中，并用水定容至刻度，混勻。取適量上清液過(guò)0.22 μm濾膜，待液相色譜儀測(cè)定。

2 數(shù)學(xué)模型的建立

試樣中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的含量按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

X——食用檳榔中待測(cè)組分含量，g/kg；

ρ——樣品溶液中待測(cè)組分的濃度，mg/L；

V——試樣定容體積，mL；

m——試樣質(zhì)量，g。

3 不確定度來(lái)源

根據(jù)試驗(yàn)方法可知，食用檳榔中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉含量測(cè)定的不確定度包括：① 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制；② 標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合；③ 樣品定容；④ 樣品稱(chēng)量；⑤ 回收率及儀器隨機(jī)效應(yīng)。

4 結(jié)果與分析

4.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度

分別稱(chēng)取苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品59.32 mg、山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品30.55 mg、糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)品85.69 mg于50 mL容量瓶中，將苯甲酸、山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解并定容，糖精鈉用超純水溶解定容。從3種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中分別取5 mL置于同一50 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，即為標(biāo)準(zhǔn)母液。

上述操作中不確定度來(lái)源于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度、稱(chēng)量及容量瓶定容。

4.1.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度 根據(jù)中檢院給出的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度為99.0%，99.8%，99.9%，按矩形分布，則其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

4.1.2 稱(chēng)量引入的不確定度 分析天平精確至0.000 01 g，區(qū)間半寬度αm=0.005 mg，假設(shè)其為矩形分布，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

稱(chēng)取苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品59.32 mg、山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品30.55 mg、糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)品85.69 mg，則稱(chēng)量產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

urel苯(m)= 2.89×10-3/59.32=4.87×10-5；

urel山(m)= 2.89×10-3/30.55=9.46×10-5；

urel糖(m)= 2.89×10-3/85.69=3.37×10-5。

4.1.3 定容引入的不確定度

(1) 容器及移液引入的不確定度：根據(jù)中華人民共和國(guó)國(guó)家計(jì)量檢定規(guī)程[7]，(25±1) ℃時(shí)，50 mL單標(biāo)線容量瓶(A級(jí))容量允差為±0.05 mL，5 mL (B級(jí))單標(biāo)線移液管允差為0.030 mL，假設(shè)其為矩形分布，則

(2) 溫度引入的不確定度：實(shí)驗(yàn)室溫度在(20±5) ℃之間變化，溶液溫度與校準(zhǔn)溫度(20 ℃)不同所引起的變化為5 ℃×2.08×10-4℃-1=1.04×10-3(2.08×10-4℃-1為水的膨脹系數(shù))，假設(shè)其為矩形分布，則

溫度對(duì)定容體積影響所引入的不確定度為：

定容及移液引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

由此得出標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.2 繪制工作曲線引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

4.2.1 移取定容引入的不確定度

(1) 移液管引入的不確定度：分別用10 mL移液管準(zhǔn)確吸取苯甲酸、山梨酸和糖精鈉混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液0.5，2.0，4.0，6.0，8.0 mL置于10 mL容量瓶中，加入超純水定容至刻度，搖勻后配制成苯甲酸濃度為5.9，13.7，47.5，71.2，94.9，118.6 mg/L；山梨酸濃度為3.1，12.2，24.4，36.7，48.9，61.1 mg/L；糖精鈉濃度為8.6，34.3，68.6，102.8，137.1，171.4 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。10 mL分度移液管(A級(jí))允差為±0.02 mL，假設(shè)其為矩形分布，則

(2) 容量瓶引入的不確定度：10 mL單標(biāo)線容量瓶(A級(jí))容量允差為±0.025 mL，假設(shè)其為矩形分布，則

移取定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度 根據(jù)HPLC檢出濃度和峰面積之間的關(guān)系如表1所示。

表1 濃度與峰面積關(guān)系

采用最小二乘法對(duì)濃度x和峰面積y進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得到苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=32.534 7x-6.605 2，r=0.999 9；山梨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=63.799 7x-16.607 3，r=0.999 8；糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=22.411 4x-1.719 2，r=0.999 9。

則由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

(2)

式中：

s(A)——工作液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)差；

Scc——溶液含量殘差的平方和；

n——測(cè)量次數(shù)；

p——濃度梯度，mg/L；

a——標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，苯甲酸、山梨酸、糖精鈉斜率分別為32.534 7，63.799 7，22.411 4；

b——標(biāo)準(zhǔn)曲線截距，苯甲酸、山梨酸、糖精鈉截距分別為6.605 2，16.607 3，1.719 2。

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度按式(3)計(jì)算：

(3)

標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(q)和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(q)如表2 所示。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線不確定度結(jié)果分析

由此得出標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.3 定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

4.3.1 容器定容引入的不確定度 樣品溶液定容于25 mL

容量瓶中，容量瓶(量入式，A級(jí))容量允差為±0.03 mL，按矩形分布，則

4.3.2 溫度引入的不確定度 溫度代入的體積影響為25 mL×5 ℃×2.08×10-4℃-1=2.6×10-2mL，假設(shè)為矩形分布，則

樣品定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.4 稱(chēng)量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

稱(chēng)取粉碎后的賓之郎爆珠檳榔2 g，考慮到稱(chēng)量分兩次進(jìn)行，分析天平最大的允差為0.000 5 g，假設(shè)為矩形分布，則

4.5 提取過(guò)程對(duì)樣品回收率影響引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

(4)

(5)

(6)

(7)

式中：

n——測(cè)量次數(shù)，n=9。

經(jīng)計(jì)算提取過(guò)程不確定度結(jié)果如表3所示。

表3 提取過(guò)程不確定度結(jié)果分析

4.6 隨機(jī)效應(yīng)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

用同一樣品做6個(gè)平行得到苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的平均含量，取矩形分布，則

(8)

urel(crep)=u(crep)/c。

(9)

經(jīng)計(jì)算隨機(jī)效應(yīng)不確定度結(jié)果如表4所示。

表4 隨機(jī)效應(yīng)不確定度結(jié)果分析

4.7 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

綜上所述，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度如表5所示。

表5 各個(gè)分量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度匯總

上述各分量相對(duì)不確定度合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.8 擴(kuò)展不確定度

在95%置信區(qū)間下，取包含因子k=2，得相對(duì)擴(kuò)展不確定度為：

Urel苯(X)=k×urel(x)=2×0.049 3=0.098 6；

Urel山(X)=k×urel(x)=2×0.059 0=0.118；

Urel糖(X)=k×urel(x)=2×0.030 8=0.061 6。

得擴(kuò)展不確定度為：

U苯=0.043 8 g/kg×0.098 6=0.004 10 g/kg；

U山=0.260 g/kg×0.118=0.030 7 g/kg；

U糖=3.25 g/kg×0.061 6=0.200 g/kg。

綜上可得：食用檳榔中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉含量測(cè)定結(jié)果為：

X苯=(0.043 8±0.004 10) g/kg (k=2)；

X山=(0.260±0.030 7) g/kg (k=2)；

X糖=(3.25±0.200) g/kg (k=2)。

5 結(jié)論

通過(guò)對(duì)食用檳榔檢測(cè)過(guò)程中標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、樣品定容、樣品稱(chēng)量、回收率及儀器隨機(jī)效應(yīng)產(chǎn)生的不確定度進(jìn)行分析。測(cè)定苯甲酸含量中標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合和隨機(jī)效應(yīng)代入的不確定度分別為67.5%，17.9%；測(cè)定山梨酸和糖精鈉含量中標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的不確定度分別為80.7%，10.1%，提取過(guò)程代入的不確定度分別為70.2%，15.8%。因此在今后的檢測(cè)工作中，針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合代入不確定度的問(wèn)題應(yīng)該增加標(biāo)準(zhǔn)系列儲(chǔ)備液的測(cè)定次數(shù)、使用精密度更高的量器具和合理確定標(biāo)液濃度的區(qū)間范圍；其次是隨機(jī)效應(yīng)和提取過(guò)程代入的不確定度的問(wèn)題應(yīng)該加強(qiáng)操作人員的熟練度、規(guī)范試驗(yàn)操作，減少人為因素對(duì)提取過(guò)程的影響，從而提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。