高強度超聲對鷹嘴豆分離蛋白結構和功能特性的影響

望運滔 - 王營娟 - 田金風 - 白艷紅 - 趙電波 -

(1. 鄭州輕工業大學食品與生物工程學院,河南 鄭州 450000；2. 河南省冷鏈食品質量安全控制重點實驗室，河南 鄭州 450000；3. 河南省食品生產與安全協同創新中心，河南 鄭州 450000)

消費者對植物蛋白食品原料的興趣日益增強[1]，其中鷹嘴豆蛋白可作為大豆蛋白的潛在替代品[2]。鷹嘴豆主要分布于新疆、青海、甘肅和云南等地[3]，其分離蛋白具有產量高、成本低、必需氨基酸組成平衡性好、生物利用度高、致敏性低等優點[4-6]，而植物蛋白的功能特性會影響其在食品工業中的應用[2]。Boye等[7]研究表明，鷹嘴豆分離蛋白具有有限的功能特性。

超聲技術是一項新興的綠色技術，已被廣泛應用于各個領域[8-10]，其超聲波通常被分為高頻率低場強和低頻率高場強兩種范圍。高頻率低場強通常指頻率為0.1～1.0 MHz，場強<1 W/cm2，低強度超聲常用于評價食品的理化性質，如酸度、糖含量、硬度、成熟度等[11]；低頻率高場強是指頻率為20～100 kHz，場強為10～1 000 W/cm2，高強度超聲產生的空化作用和機械效應可以改變食品的物理和化學性質[11-12]。研究表明，高強度超聲對卵清蛋白[13]、肌原纖維蛋白[14]、大豆蛋白[15]等蛋白質結構和功能性質存在影響，且差異顯著。例如，超聲處理對卵清蛋白乳化性無明顯影響[10]，但能顯著提高雞肉肌原纖維蛋白的乳化性[14]。此外，超聲處理可增加大豆分離蛋白自由巰基含量[15]，同時減少牛血清蛋白自由巰基含量[16]。試驗擬探討高強度超聲對鷹嘴豆分離蛋白結構和功能特性的影響，旨在為生產具有特定功能性質的鷹嘴豆分離蛋白提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

卡布里鷹嘴豆(CicerarietinumLinn.)：云南省文州自治區丘北市天星鄉；

正己烷、氫氧化鈉、鹽酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉氫、十二烷基硫酸鈉、甘氨酸、5,5-二巰基-2,2-二硝基苯甲酸：上海源葉生物科技有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

分析天平：AB265-S型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

電子天平：JA3003N型，上海菁海儀器有限公司；

錘式實驗粉碎磨：LM3100型，伊伊西科技(北京)有限公司；

水浴鍋：HH-42型，常州萬科儀器科技有限公司；

質構分析儀：TA-XT Plus型，英國Stable Micro System公司；

冷凍干燥機：Lab-1-50型，北京博醫康實驗儀器有限公司；

超聲波破碎儀：VC-750型，美國SONICS公司；

納米粒度電位儀：Zetasizer Nano ZS型，英國馬爾文儀器設備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 鷹嘴豆分離蛋白的提取 將鷹嘴豆于50 ℃烘箱中烘干，粉碎，過80目篩，采用正己烷脫脂，得脫脂粉。采用堿溶酸沉法提取鷹嘴豆分離蛋白，透析，冷凍干燥，得鷹嘴豆蛋白粉末。其蛋白質含量為81.9%，灰分為3.8%，水分為6.3%，脂肪為1.9%。

1.2.2 超聲處理 配置質量分數為8%的鷹嘴豆分離蛋白溶液，采用超聲設備對其進行超聲處理，冷凍干燥，備用。超聲波探頭直徑13 mm，頻率20 kHz，功率450 W，超聲時間分別為5，10，20 min；脈沖工作時間2 s，間歇時間4 s。

1.2.3 鷹嘴豆分離蛋白理化性質測定

(1) 溶解度：根據文獻[17]略作修改。將1%的蛋白懸濁液于8 000 r/min離心15 min，取1 mL上清液加入到4 mL雙縮脲試劑中，混勻，避光反應30 min，測定540 nm 處吸光率。

(2) 粒徑和電位：配置濃度為1 mg/mL的鷹嘴豆分離蛋白溶液，采用激光粒度儀測量鷹嘴豆分離蛋白粒徑和zeta電位。

1.2.4 蛋白質界面性質測定

(1) 乳化性：取1%的蛋白溶液15 mL，加入5 mL大豆油，10 000 r/min高速攪拌2 min，制備乳液。立即取100 μL乳液加入至5 mL 0.1% SDS溶液中，振蕩混勻，測定500 nm處吸光度。乳液靜置10 min后，取100 μL乳液至5 mL 0.1% SDS溶液中，振蕩混勻，測定吸光度。按式(1)、(2)計算乳化活性和乳化穩定性[18]。

(1)

(2)

式中：

EAI——乳化性，m2/g；

ESI——乳化穩定性，min；

N——稀釋倍數；

A0——0 min時吸光度；

A10——10 min時吸光度；

c——蛋白濃度，g/mL；

θ——油體積分數。

(2) 起泡性和泡沫穩定性：取5%的鷹嘴豆分離蛋白分散液15 mL，8 000 r/min均質2 min(均質20 s停20 s，共6次)，然后快速轉入量筒中，分別記錄2，30 min時泡沫體積[13]。按式(3)、(4)計算起泡性和泡沫穩定性。

(3)

(4)

式中：

FA——起泡性，%；

FS——泡沫穩定性，%；

V0——2 min時泡沫體積，mL；

V30——30 min時泡沫體積，mL。

1.2.5 蛋白質凝膠性質測定

(1) 凝膠保水性：配置質量分數為14%的鷹嘴豆分離蛋白溶液，90 ℃水浴1 h，冷卻，于4 ℃冷藏過夜。將制備好的凝膠于8 000 r/min離心15 min，用濾紙拭干凝膠表面水分，稱重，按式(5)計算持水量。

(5)

式中：

WHC——保水性，%；

m1——初始凝膠質量，g；

m2——離心后凝膠質量，g。

(2) 凝膠破裂力：使用質構儀和P/0.5柱形鋁探針進行測量。預試速度1.0 mm/s，測試速度1.0 mm/s，上試速度2.0 mm/s，測試距離10.0 mm，觸發力10 g。

1.2.6 超聲處理對鷹嘴豆分離蛋白結構的影響

(1) SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳：制備12%分離膠和5%濃縮膠，將40 μL濃度為4 mg/mL的鷹嘴豆分離蛋白溶液加至40 μL還原液中，震蕩混勻，100 ℃水浴5 min，冷卻。取10 μL混合物加至濃縮凝膠中，80 V下電泳30 min，再110 V電泳1.5 h，用考馬斯亮藍G250染色30 min，脫色。

(2) 圓二色譜：用磷酸緩沖液(10 mmol/L，pH 7)配制濃度為1 mg/mL的鷹嘴豆分離蛋白溶液。10 000 r/min離心15 min，采用雙縮脲試劑法測定上清液蛋白溶解度。將蛋白用磷酸鹽緩沖液稀釋至0.1 mg/mL，帶寬1.0 nm，光譜測量范圍190～260 nm[13]。

(3) 內源熒光：鷹嘴豆分離蛋白(0.1 mg/mL)的制備方法同1.2.6(1)，激發波長290 nm，發射波長298～400 nm，發射狹縫寬度2.5 nm，掃描速度1 200 nm/min。

(4) 表面疏水性：根據文獻[16]并修改。用磷酸緩沖液(0.01 mol/L，pH 7)配置濃度為1 mg/mL的鷹嘴豆分離蛋白溶液，并分別稀釋至0.100，0.050，0.025，0.005，0.001 mg/mL。將ANS溶于磷酸緩沖液(0.01 mol/L，pH 7)，取30 μL ANS溶液加至3 mL蛋白溶液中，用熒光分光光度計測量熒光值。激發波長385 nm，發射波長490 nm。通過線性回歸分析將熒光強度和蛋白濃度的初始斜率作為表面疏水性。

(5) 自由巰基：取0.1 g鷹嘴豆分離蛋白溶于50 mL Tris-HCl緩沖液(含86 mmol/L Tris，90 mmol/L甘氨酸，4 mmol/L DTNB，pH 8)，用磁力攪拌器攪拌30 min， 10 000 r/min離心15 min。取50 μL DTNB溶液(4 mg/mL)加至5 mL蛋白上清液中，避光反應15 min，測定412 nm處吸光度。按式(6)計算巰基。

(6)

式中：

SH——巰基，μmol/g；

D——稀釋倍數；

C——蛋白濃度,g/mL；

A——412 nm處反應液與蛋白空白溶液吸光度的差值。

1.2.7 數據處理 所有試驗重復3次，數據用平均值±標準差表示。采用Origin 9軟件作圖。采用SPSS 21.0軟件進行統計分析，利用單因素方差分析(ANONA)對數據進行統計分析，采用Duncan’s方法對均值進行多重比較分析，字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2 結果與討論

2.1 對鷹嘴豆分離蛋白理化性質的影響

2.1.1 溶解度 由圖1(a)可知，超聲處理可顯著提高鷹嘴豆分離蛋白溶解度，且隨超聲處理時間的延長而增大。當超聲時間為20 min時，鷹嘴豆分離蛋白溶解度達最大值9.2 mg/mL。超聲的空化和機械效應可將粒徑較大的蛋白質聚集體解聚成粒徑較小的蛋白質顆粒，從而降低蛋白質聚集體粒徑，增強蛋白質與水的相互作用，使蛋白質溶解度增加[19]。

2.1.2 粒徑 由圖1(b)可知，超聲處理降低了鷹嘴豆分離蛋白團聚體在溶液中的粒徑，是由于超聲處理過程中產生的空化、剪切力和湍流作用加速了蛋白質團聚體的碰撞和聚集速度，不穩定的蛋白質團聚體被解聚成更小的蛋白質顆粒[20]。此外，超聲處理過程中產生的能量破壞了蛋白質的非共價相互作用，如氫鍵和疏水相互作用，從而降低蛋白質分子間作用力，進而降低蛋白質顆粒的粒徑[21]。

圖1 超聲處理對鷹嘴豆分離蛋白理化性質的影響

2.1.3 電位 由圖1(c)可知，高強度超聲處理使蛋白質表面凈電荷的絕對值降低，表明超聲處理使鷹嘴豆分離蛋白基團的電離程度減弱，可能是因為超聲處理過程中暴露了更多的正電荷基團，中和了蛋白質表面的部分負電荷[22]。此外，親疏水基團之間的平衡也會影響蛋白質的表面電荷[13]。

2.2 對鷹嘴豆分離蛋白界面性質的影響

2.2.1 泡沫性質 由圖2(a)可知，鷹嘴豆分離蛋白起泡性隨超聲時間的增加顯著增強，而泡沫穩定性無明顯變化。當超聲時間為20 min時，起泡性達最大值163.33%，是未處理組的2.33倍，可能是因為超聲的空化作用降低了鷹嘴豆分離蛋白分子的聚集程度，從而增強了蛋白質的柔韌性，使鷹嘴豆分離蛋白更容易吸附在氣—水界面[13]。Xiong等[13]研究表明表面疏水性的增加和表面凈電荷的減少有利于增強蛋白質的起泡性。

2.2.2 乳化性 由圖2(b)可知，超聲處理后鷹嘴豆分離蛋白的乳化活性略高于未處理組，可能是由于蛋白質結構和表面基團發生了變化。此外，溶解度的增加也有助于改善蛋白質的乳化活性，因為更多的可溶性團聚體會使蛋白質與水之間的相互作用增強，使蛋白質在油水界面迅速擴散和吸收，從而有利于提高蛋白質在油水界面的吸附能力[23-24]。

圖2 超聲處理對鷹嘴豆分離蛋白界面性質的影響

2.3 對鷹嘴豆分離蛋白凝膠特性的影響

2.3.1 凝膠破裂力 由圖3(a)可知，與未處理組相比，熱誘導凝膠的破裂力隨超聲時間的延長而增大，可能是因為超聲預處理改變了蛋白質的非共價相互作用。一方面，溶解度的增加會產生更多的可溶性蛋白團聚體，這些團聚體加熱后會形成密度更大的蛋白凝膠網絡。此外，粒徑的減小會使凝膠網絡結構更加致密均勻，進一步提高其凝膠破裂力。另一方面，超聲處理后，鷹嘴豆分離蛋白溶液在加熱形成凝膠時產生更多的二硫鍵[10]，使凝膠結構更加穩定，凝膠破裂力增強[25]。

2.3.2 保水性 由圖3(b)可知，凝膠保水性隨超聲時間的延長而增大。超聲處理后，鷹嘴豆分離蛋白溶解度增大，粒徑減小，從而使凝膠網密度增大，結構更加致密，蛋白凝膠能結合更多水[26]。

圖3 超聲處理對鷹嘴豆分離蛋白凝膠特性的影響

2.4 對鷹嘴豆分離蛋白結構的影響

2.4.1 電泳 還原條件下，鷹嘴豆分離蛋白的主要亞基結構分別是convicilin和vicilin[27]。由圖4可知，70 kD處條帶代表的是aconvicilin[27-29]，50 kDa處條帶代表的是vicilin；超聲處理組與未超聲處理組的鷹嘴豆分離蛋白之間的條帶差異不顯著，說明超聲處理并沒有改變蛋白亞基的種類、數量和分子量[13]。

M. 蛋白Marker 1. 超聲0 min 2. 超聲5 min 3. 超聲10 min 4. 超聲20 min

2.4.2 圓二色譜 由表1和圖5(a)可知，相比于未處理組，超聲處理后鷹嘴豆分離蛋白的圓二色譜峰值強度略有增強。未處理組的α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規則卷曲含量分別為17.7%，32.5%，16.5%，33.0%。超聲處理后，鷹嘴豆分離蛋白的α-螺旋含量略有增加，β-折疊含量減少，β-轉角和無規則卷曲含量無顯著變化，與Vere等[30]的結論一致。而Zhu等[23]研究發現超聲處理使蛋白質的β-折疊含量增多，α-螺旋含量減少，可能是由于超聲條件和蛋白質類型的不同所致。綜上，高強度超聲處理改變了鷹嘴豆分離蛋白的二級結構。

表1 超聲時間對鷹嘴豆分離蛋白二級結構的影響

2.4.3 內源熒光 由圖5(b)可知，未處理組的最大熒光強度波長為326 nm，超聲處理后該波長為331 nm，表明超聲處理使蛋白的發射波長紅移5 nm，發射波長紅移可以反映蛋白質構象的變化，說明位于蛋白質內部的芳香氨基酸分子側鏈基團逐漸暴露于水溶液中，其環境極性逐漸增大；超聲處理后鷹嘴豆分離蛋白的熒光強度降低。綜上，超聲處理改變了蛋白質的三級結構。

2.4.4 巰基 由圖5(c)可知，游離巰基含量隨超聲時間的延長先增加后減少，是由于原本位于鷹嘴豆分離蛋白內部的巰基經超聲處理后逐漸暴露于蛋白分子表面，從而使巰基含量增加；但隨著超聲時間的繼續延長，游離巰基含量逐漸減小，主要是因為長時間高強度超聲處理會產生過氧化氫，使游離巰基被氧化，進而降低游離巰基含量[16]。蛋白質中游離巰基含量反映了其空間結構的變化，巰基含量增多，證明蛋白質結構展開，蛋白質分子柔性增加，進而有利于蛋白質溶解性和乳化性的提高，并且在熱誘導凝膠形成過程中，游離巰基可以轉化為二硫鍵，二硫鍵是維持凝膠形成的主要作用力，有利于形成致密的空間網狀結構，進而有助于提高鷹嘴豆分離蛋白凝膠的保水性和破裂力。

圖5 超聲處理對鷹嘴豆分離蛋白結構的影響

2.4.5 表面疏水性 由圖5(d)可知，超聲處理后鷹嘴豆分離蛋白的表面疏水性高于未處理組。蛋白質表面疏水性的增加可以提高蛋白質在油—水和氣—水界面的吸附特性，從而有利于改善蛋白質的乳化性和起泡性。

3 結論

450 W高強度超聲可以顯著改善鷹嘴豆分離蛋白的溶解度、乳化性、起泡性以及熱致凝膠性。此外，超聲處理使蛋白的表面游離巰基含量和表面疏水性顯著增大，粒徑和電位絕對值顯著降低，并且改變了蛋白質的二級和三級結構。試驗研究了高強度超聲處理對鷹嘴豆蛋白功能性質的影響，而未詳細研究此處理改變功能性質的機制，因此后續研究應進一步詳細深化此部分研究。