貯藏條件對扁桃仁分離蛋白理化特性及消化特性的影響

王煒清 - 李秀婷 - 周 彬 李述剛 -

(1. 湖北工業大學生物工程與食品學院，湖北 武漢 430068；2. 北京工商大學食品與健康學院，北京 102488)

扁桃(AmygdaluscommunisL.)又名巴旦木或巴旦仁，是世界上著名的干果樹種和木本油料樹種[1]。扁桃仁營養豐富，含有大量脂肪、蛋白質、粗纖維、維生素及礦質元素等[2-3]，同時扁桃仁還具有廣泛的保健作用，如可降低糖尿病和冠心病等疾病的發生[4-5]。但其高脂肪和高蛋白特性使其在加工過程中易發生品質劣變，如顏色、風味等變化，極大地限制了扁桃仁蛋白質在食品領域的應用。貯藏是產品加工過程中不可避免的一個環節，不同的貯藏條件將直接影響產品品質及貨架期。目前，研究者們[6-8]重點探究堅果油在貯藏過程中的變化，忽略了其蛋白質的品質變化。

試驗擬以扁桃仁分離蛋白(almond protein isolate，API)為研究對象，以貯藏過程API結構與功能特性為觀測指標，重點探究不同貯藏條件對API消化特性的影響，以期為富含脂質和蛋白質的堅果類產品的貯藏與開發利用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

扁桃仁：購自新疆莎車縣農貿市場；

5,5’-二硫代二硝基苯甲酸鹽(DTNB)、2,4-二硝基苯肼(DNPH)、8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)：優級純，美國Sigma公司；

二硫蘇糖醇(DTT)：分析純，Aladdin阿拉丁試劑公司；

鄰苯二甲醛(OPA)：優級純，美國Sigma公司；

其他試劑：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設備

雙光束紫外可見分光光度計：TU-1900型，北京普析通用儀器有限責任公司；

圓二色光譜儀：J-1500型，日本JASCO公司；

電泳儀：DYY-8C型，北京六一有限公司；

熒光分光光度計：F-4600型，日本日立公司；

氨基酸分析儀：L-8900型，日本日立公司；

質譜儀：Q Exactive型，美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理 扁桃仁去殼烘干后進行真空與非真空包裝，置于不同溫度(4，25，35 ℃)下貯藏，分別于貯藏第0，1，3，6，9個月取樣進行檢測。

1.2.2 基本營養成分測定

(1) 水分含量：參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》。

(2) 蛋白質含量：參照GB 5009.5—2006《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》的凱氏定氮法。

(3) 脂肪含量：參照GB 5009.6—2016《食品中安全國家標準 食品中水分的測定》。

(4) 還原糖含量：參照GB 5009.7—2016《食品安全國家標準 食品中還原糖的測定》。

(5) 灰分含量：參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》。

(6) 氨基酸組成：參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》。

1.2.3 扁桃仁蛋白的提取 采用堿溶酸沉法制備扁桃仁分離蛋白(almond protein isolate，API)[9]。將扁桃仁脫皮后進行磨粉、過篩，采用石油醚(30～60 ℃)進行脫脂得到扁桃仁脫脂粉。將脫脂粉溶于超純水中[1∶30 (g/mL)]并調節pH至9.5，35 ℃攪拌3 h后以8 000×g離心20 min。將上清液pH調至4.5，靜置15 min 后在4 ℃ 下8 000×g離心20 min，水洗沉淀2次。將沉淀物分散于超純水中并調節pH至7.0，并在4 ℃ 下透析3 d，冷凍干燥得蛋白粉。

1.2.4 理化特性測定

(1) 巰基、二硫鍵的測定：采用Ellman's試劑法[10]。

(2) 羰基價的測定：采用DNPH法[11]。

(3) 表面疏水性的測定：參照Arzeni等[10]的方法，用ANS熒光探針測定蛋白質的表面疏水性(Ho)。

1.2.5 結構特性測定

(1) 二級結構的測定：配制0.2 mg/mL的API溶液于0.1 cm的石英比色皿中，掃描波長為190～250 nm，掃描速率為100 nm/min。

(2) 聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳：參照Moritz等[12]的方法，利用SDS-PAGE對蛋白質分子量變化進行分析。濃縮膠與分離膠的濃度分別為4%，12%，電壓分別設置為70，100 V。

1.2.6 功能特性測定

(1) 溶解性：根據Qu等[13]的方法，稍作修改。將API溶液(10 mg/mL)在室溫下攪拌1 h，以8 000 ×g離心20 min，上清液的蛋白質濃度采用考馬斯亮藍法測定，按式(1)計算溶解度。

(1)

式中：

S——溶解度，%；

C0——樣品中蛋白質含量，mg；

C1——上清液中蛋白質含量，mg。

(2) 起泡特性：參照胡靜[14]的方法，利用泡沫分析儀對扁桃蛋白的起泡性能進行測定。樣品濃度為10 mg/mL。

1.2.7 消化特性的測定

(1) 消化率：將1 mL胃蛋白酶溶液(40 mg/mL)加入到20 mL樣品溶液(10 mg/mL)中，并將混合物的pH調節至2.0。將混合物在37 ℃水浴中于黑暗中振蕩3 h。最后，用0.1 mol/L NaHCO3溶液將樣品溶液的pH值調節至7.0，以終止反應[15]。采用OPA試劑法[16]測定API在消化過程中水解度變化。

(2) 消化產物分析：肽段的分析使用Dionex 3000 RSLC UHPLC系統串聯Q Exactive質譜儀。使用Proteome Discoverer 1.4 (version 1.4, Thermo Fisher Scientific, Palo Alto, CA, USA)匹配肽MS/MS譜；使用標準蛋白數據庫(www.uniprot.org, UP000009136)與Sequent搜索算法對數據進行分析；利用Venn圖分析多肽的相似性[17]。

1.2.8 數據處理 所有試驗均平行3次，采用SPSS 23.0分析軟件對數據進行顯著性分析，利用Origin 2017軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 扁桃仁的營養成分分析

由圖1可知，扁桃仁富含脂質(53.53%)與蛋白質(21.60%)；扁桃油主要由油酸(C18:1)與亞油酸(C18:2)組成，不飽和脂肪酸含量較高(72.98%)。由表1可知，扁桃仁蛋白質含有18種氨基酸，必需氨基酸種類全、含量充足，且相互比例適當。由此可知，扁桃仁是一種營養組成全面，富含脂質和蛋白質的優質堅果資源。

表1 扁桃仁蛋白質的氨基酸組成

圖1 扁桃仁的基本成分及其脂肪酸組成

2.2 貯藏條件對扁桃仁蛋白質理化特性影響

蛋白質分子中的巰基和二硫鍵對其結構和功能特性均有影響，如蛋白質的凝膠性、界面行為和消化性能等[18]。如圖2(a)～(d)所示，不同貯藏條件下API游離巰基和二硫鍵的含量不同。隨著貯藏時間的延長，所有樣品的巰基含量均顯著降低，對照組(儲存0 d)的巰基含量為20.64 μmol/g，而非真空包裝于35 ℃貯藏9個月后其巰基含量降低了60.7%。結果表明較高的貯藏溫度可導致API的巰基含量顯著降低。而貯藏期間，API的二硫鍵含量變化趨勢與巰基相反。隨著貯藏時間的延長，二硫鍵含量從11.32 μmol/g增加到30.21 μmol/g。這可能是貯藏過程中的氧氣、光以及脂質氧化會誘導扁桃仁中蛋白質的氧化變性，而蛋白質變性和二硫鍵的形成都可能導致巰基含量的減少。

蛋白質氧化的另一個重要變化是羰基(包括醛基和酮基)的形成。氨基酸側鏈的直接氧化、肽鏈的裂解、糖的還原或與非蛋白質羰基化合物的結合均可產生羰基[18]。如圖2(e)和(f)所示，對照樣品的羰基含量為0.11 μmol/g，隨著貯藏時間的延長，所有樣品的羰基值急劇增加(P<0.05)。另外，相同的貯藏時間下，不同的貯藏溫度也會引起羰基值的顯著差異，且羰基值與貯藏溫度呈正相關。劉寶華等[19]研究大豆分離蛋白質在貯藏期的變化，結果表明隨貯藏時間的延長，蛋白質羰基值逐漸增加，與試驗的變化趨勢相同。

蛋白質分子的表面疏水性可以反映其表面疏水基團的相對含量，是維持蛋白質結構的重要特性[18]。如圖2(g)和(h)所示，隨著貯藏時間的延長，表面疏水性呈明顯的上升趨勢。真空包裝處理的扁桃仁在35 ℃貯藏9個月后，API表面疏水性變化最為顯著，從3 050增加到8 142。這可能是由于：扁桃仁貯藏期間，外部因素會誘導蛋白質氧化，導致其構象發生變化。隨著氧化程度的增加，API分子逐漸展開，其內部疏水基團暴露，導致表面疏水性增加。

*表示在0.1水平上顯著

2.3 貯藏條件對扁桃仁蛋白質結構特性的影響

2.3.1 二級結構 試驗通過蛋白質二級結構的變化考察不同貯藏條件下API的氧化程度。由表2可知，隨著貯藏時間的延長，β-折疊和無規則卷曲的含量逐漸增加，而α-螺旋和β-轉角的含量降低。非真空條件下(35 ℃)貯藏9個月后，API的α-螺旋含量從31.4%降低到19.1%，β-折疊含量從30.1%增加到43.5%，β-轉角含量從12.1%降低到2.5%，無規則卷曲從26.5%增加到34.9%。比較兩種包裝條件下的貯藏樣品，發現在真空包裝條件下，API二級結構含量的變化略低于非真空包裝組。吳偉等[20]研究發現貯藏過程中大米蛋白質的無序結構逐漸增加，二級結構穩定性逐漸降低。

表2 貯藏期間API二級結構的變化

2.3.2 SDS-PAGE 圖3顯示了API在不同貯藏條件下的電泳圖譜，初始API的分子量主要集中分布在35～40 kDa 和10～15 kDa，隨貯藏時間的延長，在15 kDa和35～40 kDa左右的主要蛋白帶逐漸消失或消失，而在50～70 kDa的蛋白帶則明顯增厚；尤其是貯藏超過6個月后，在泳道的頂部出現條帶。隨著貯藏時間的延長，蛋白質的遷移率逐漸降低，可能是由于過氧自由基蛋白的氧化導致了API分子中的共價交聯，形成高分子量聚集體。同時，蛋白質氧化的加深也將導致某些蛋白質分子的降解，從而在低分子量區域產生離散的條帶。

1～3. 分別于4，25，35 ℃貯藏的真空包裝樣品 4～6. 分別于4，25，35 ℃貯藏的非真空包裝樣品 Mark. 蛋白質標品

2.4 貯藏條件對扁桃仁蛋白質功能特性的影響

如圖4(a)和(b)所示，隨著貯藏時間的延長，API的溶解度明顯降低。非真空包裝、35 ℃貯藏9個月后，其溶解度降低了85.3%。貯藏期間API溶解度降低的主要原因有兩個：① 貯藏過程中蛋白質氧化導致蛋白質分子之間的交聯，形成較大分子量的聚集體，最終導致API溶解度降低；② API的表面疏水性在貯藏過程中增強，并且暴露的疏水基團可能通過疏水性相互作用聚集，導致溶解度降低。何鐘瑜等[21]研究發現蛋黃在不同溫度下貯藏后，溶解度均發生下降，并認為這可能是蛋白質氧化所致。

如圖4(c)～(f)所示，隨貯藏時間的延長，API的起泡能力與泡沫半衰期逐漸降低。API起泡特性在貯藏期間發生變化可能是由于隨著API氧化程度的加深，不斷暴露的疏水基團形成不可溶的聚集體，改變了蛋白質分子的表面張力和氣—液界面的穩定性，最終導致其起泡能力與泡沫穩定性顯著下降[22]。另外，有研究[23]表明蛋白質氧化會導致其溶解性和結構穩定性下降，進而影響蛋白質的起泡特性，該結果與API分子量、溶解性等變化趨勢相符。

*表示在0.1水平上顯著

2.5 貯藏條件對扁桃蛋白消化特性的影響

2.5.1 消化率 貯藏引起的蛋白質氧化可能導致一系列氨基酸的丟失和變性，可能導致API及相關產品的營養價值顯著下降。因此，通過體外模擬胃消化試驗研究了不同貯藏條件處理的API消化特性(圖5)，研究發現，不同貯藏條件處理API經胃蛋白酶酶解后，體外消化率表現出顯著差異(P<0.05)。3個溫度下貯藏9個月后，API的水解度顯著降低，而較高的溫度導致水解度的降低更為顯著。這可能是較高的溫度和較長的貯藏時間導致API氧化，形成共價交聯的氧化聚集體，掩蓋了API胃蛋白酶的作用部位，從而減慢了胃蛋白酶的消化過程并抑制了API的消化。同時，這與蛋白質氧化晚期階段聚集體的形成有關，一方面抵消了蛋白質結構展開的作用，另一方面，氨基酸的損失也影響了酶促水解的速率。此外，已有研究[24]表明二級結構的含量會影響蛋白質的體外消化率，α-螺旋的含量越高，蛋白質的消化越容易，而β-折疊的含量越高，則抑制蛋白質消化。何莉媛等[25]研究也發現貯藏期間米糠蛋白的消化率隨貯藏時間逐漸降低。

圖5 貯藏條件對API消化率的影響

2.5.2 消化產物分析 基于MS對API消化產物分子量分析，以進一步評估在不同貯藏條件長期貯藏后扁桃仁的蛋白質消化率的差異。如圖6所示，API消化產物的分子量主要集中在3 000 Da以下，貯藏9個月后，API消化產物分子量增大。這也證實了水解度的結果，該水解會抑制API的消化。圖7顯示了初始樣品及分別在4，25，35 ℃真空包裝的樣品貯藏9個月后經胃蛋白酶處理得到的獨有肽段數，分別為9 618，8 851，8 354，8 554，其中有2 147個共有肽段。初始樣品與非真空包裝在4，25，35 ℃貯藏9個月后的樣品，分別具有9 663，9 037，8 888，6 728個獨有肽段。此外，非真空包裝的扁桃仁于35 ℃貯藏9個月后，API消化產物的肽段數量從13 096急劇減少至8 662，這是由于蛋白質的消化率越高，獨有肽段的數量越多，該結果與水解度的結果一致。

圖6 不同貯藏條件下的API消化產物的肽指紋圖譜

圖7 不同貯藏條件下API肽段韋恩圖

3 結論

通過探討扁桃仁分離蛋白在不同貯藏溫度、包裝方式以及貯藏時間下的理化指標、結構與功能特性、消化特性變化來探究其貯藏特性，結果表明扁桃仁分離蛋白在貯藏期間結構特性發生改變，進而影響其功能特性與消化特性。因此，在扁桃的加工、貯運過程中，應盡量避免扁桃仁蛋白質暴露在劇烈的環境條件中，防止蛋白質品質下降造成資源流失。后續將進一步探究扁桃仁蛋白質在貯藏期間的品質變化規律與機制。