加減駐景方對大鼠脈絡(luò)膜新生血管模型的干預(yù)研究

陶方方，亢澤峰，陳水齡，褚文麗，劉健，周志豪

年齡相關(guān)性黃斑變性 （age-related macular degeneration,AMD） 是全世界主要的致盲眼病之一[1]，隨“視覺2020”行動(dòng)的開展，AMD 已成為我國50 歲以上人群致盲的重要病因。脈絡(luò)膜新生血管（choroidal neovascularization,CNV）形成出血、滲出，并反復(fù)發(fā)生，最終形成瘢痕，累及黃斑，造成中心視力的不可逆性損傷。目前，濕性AMD 的一線治療是玻璃體腔注射抗血管內(nèi)皮生長因子 （vascular endothelium growth factor,VEGF）類藥物，但是，治療有效性與安全性、給藥頻率、聯(lián)合治療方案的選擇、治療費(fèi)用昂貴等問題，尚需要進(jìn)一步解決完善。中藥加減駐景方是亢澤峰教授治療AMD、病理性近視的經(jīng)驗(yàn)用方，臨床上常與抗VEGF 類藥物聯(lián)合應(yīng)用治療CNV。本文通過659 nm 氪激光誘導(dǎo)棕色挪威（brown norway,BN）大鼠形成CNV，采用形態(tài)學(xué)和組織病理學(xué)技術(shù)，觀察加減駐景方對實(shí)驗(yàn)性CNV 形態(tài)學(xué)、組織學(xué)的影響，從而揭示加減駐景方對實(shí)驗(yàn)性CNV 的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8 周齡雄性SPF 級BN 大鼠78 只，體重180～220 g，購買于北京市維通利華公司。動(dòng)物許可證號：SCXK（京）2012-0001。實(shí)驗(yàn)前，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。

1.2 試劑與儀器

10%水合氯醛溶液（國藥集團(tuán)），熒光素鈉注射液（美國，Alcon 公司，歷設(shè)得），吲哚青綠注射液（丹東醫(yī)創(chuàng)藥業(yè)），蘇木素-伊紅染色劑（北京益利），多波長氪激光機(jī) （美國，Lumenis Inc,Laserex LP352），眼底血管造影機(jī)（日本，TOPCON,TRC.50DX），石蠟切片機(jī)（德國，Leica,RM2235），石蠟切片攤片機(jī)（德國，Leica,HI1210），石蠟切片烘片機(jī) （德國，Leica,HI1220），全自動(dòng)脫水機(jī)（德國，Leica,ASP300S），光學(xué)顯微鏡（德國，Leica,DM2500）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 CNV 模型建立與實(shí)驗(yàn)分組 健康雄性BN 大鼠，任一眼為實(shí)驗(yàn)眼，行激光造模，以有白色氣泡產(chǎn)生為Bruch’s 膜破裂的標(biāo)準(zhǔn)，視為有效點(diǎn)，每只眼光凝8～10 個(gè)點(diǎn)。激光功率360 mW，光斑直徑50μm，曝光時(shí)間0.05s。造模不成功者剔除。

按隨機(jī)數(shù)字表法將造模后的大鼠分為模型組、中藥組、西藥組、聯(lián)合組，各18 只。模型組、中藥組光凝后第1 d 分別給予生理鹽水、中藥灌胃，每日1次，共21 d。西藥組，光凝后第1 d 給予玻璃體腔注射康柏西普（成都康弘藥業(yè)），共計(jì)1 次。聯(lián)合組，光凝后第1 d 給予玻璃體腔注射康柏西普，共計(jì)1 次，中藥灌胃，每日1 次，共21 d。空白組6 只BN 大鼠，正常飼養(yǎng)，不做特殊處理。

1.3.2 給藥情況 中藥加減駐景方由楮實(shí)子、枸杞子、菟絲子、五味子、茺蔚子、三七粉、桂枝、茯苓、三棱、郁金、生黃芪和當(dāng)歸等多種藥物組成，每劑中藥共計(jì)155 g。大鼠灌胃濃度1.6 g/ml，灌胃量10 ml/kg。

康柏西普眼用注射液，規(guī)格10 mg/ml，0.2 ml/支。5 μl 微量注射器玻璃體腔注射，1 次，5 μl。

1.3.3 CNV 變化 光凝后第7 d、14 d、21 d，行眼底熒光血管造影 （fundus fluorescein angiograph,FFA）與吲哚青綠血管造影（indocyanine green angiography,ICGA）檢查。腹腔注射10%水合氯醛（3.5 ml/kg）麻醉后，拍攝眼底彩照，以10%熒光素鈉注射液（1 ml/kg）和8 mg/ml 吲哚青綠注射液（2 ml/kg）的混合液腹腔注入。拍攝注藥后30 min 內(nèi)的FFA 和ICGA 圖像，以注藥后25～30 min 為FFA 晚期圖像。計(jì)算CNV 的發(fā)生率，CNV 發(fā)生率=滲漏光斑數(shù)/激光光斑數(shù)×100%。ICGA 的CNV 充盈情況分為有和無。滲漏光斑的定義：FFA 有熒光素滲漏，且ICGA 呈現(xiàn)充盈狀態(tài)。

1.3.4 病理學(xué)標(biāo)本制備 模型組和各治療組在光凝后第7 d、14 d、21 d 行FFA 與ICGA 檢查后，各處死6 只BN 大鼠取材。空白組在光凝后21 d 行FFA 與ICGA 檢查后，處死取材。制作好的眼杯于4%多聚甲醛中4℃固定24 h，自動(dòng)脫水機(jī)脫水，60℃石蠟包埋。4 μm 連續(xù)切片，烘片機(jī)45℃烤片。HE 染色：石蠟切片脫蠟至水，蘇木素-伊紅染色，脫水透明與封片，中性樹膠封片，晾干，光學(xué)顯微鏡拍攝照片。

1.3.5 圖像分析 FFA 圖像： 每組選取18 張晚期FFA 圖像，用Image Pro Plus 6.0 軟件進(jìn)行分析，每張圖像平均光密度值（average optical density,AOD）的累積值作為該組的AOD 值。

HE 染色圖像： 每組選取18 張20×光學(xué)顯微鏡拍攝的圖像，測量RPE 到視網(wǎng)膜內(nèi)最高點(diǎn)的距離，即CNV 中央厚度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件采用SPSS 17.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用（）表示，多組間比較用單因素方差分析，兩組間比較用LSD-t 檢驗(yàn)或Dunnett T3檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用百分率表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠眼底表現(xiàn)

空白組BN 大鼠眼底照片可見視網(wǎng)膜顏色淡紅，圓形視盤居中，視網(wǎng)膜血管圍繞視盤呈放射狀分布。其FFA 圖像可見視盤居中，視網(wǎng)膜血管被熒光素鈉充盈，血管走形自如，無熒光素滲漏，ICGA 示脈絡(luò)膜血管呈網(wǎng)織狀（圖1）。

模型組和各治療組BN 大鼠眼底照片可見在視網(wǎng)膜血管間隙分布的光凝斑，光凝中心呈濃集的白點(diǎn)，周圍呈環(huán)形灰白色水腫，光凝斑邊界不清，少數(shù)光斑下可透見少量出血。隨著光凝后時(shí)間推移，視網(wǎng)膜水腫逐漸減輕，光凝斑邊界逐漸清晰，部分相鄰的光凝斑可出現(xiàn)融合。其FFA 圖像可見大致均勻分布在血管間隙的熒光素滲漏，早期熒光素滲漏呈點(diǎn)片狀，晚期呈斑片狀，滲漏熒光逐漸增強(qiáng)，ICGA 表現(xiàn)為光凝斑周圍呈高熒光，中心呈低熒光，CNV 呈花環(huán)狀充盈。有熒光素滲漏的光斑在ICGA 均呈充盈狀態(tài)。

2.2 CNV 發(fā)生率

光凝后7 d、14 d、21 d，模型組與各治療組CNV 發(fā)生率達(dá)70%以上，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

表1 光凝后不同時(shí)間各組CNV 發(fā)生率變化（n=6）

2.3 FFA 與ICGA 結(jié)果

光凝后7 d，模型組FFA 出現(xiàn)明顯熒光素滲漏，14 d、21 d 滲漏強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，t14d=2.13，P=0.054；t21d=2.61，P=0.026，21 d 與7 d 比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而14 d 與21 d 無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.36，P＞0.05）。中藥組在光凝后7 d 有明顯熒光素滲漏，14 d 與21 d熒光素滲漏較7 d 時(shí)逐漸減弱，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。西藥組與聯(lián)合組在光凝后7 d FFA 可見輕度熒光素滲漏，熒光素滲漏強(qiáng)度隨時(shí)間變化不明顯（P＞0.05）（表2）。

光凝后7 d，中藥組與模型組熒光素滲漏強(qiáng)度較高，二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），西藥組次之，聯(lián)合組滲漏程度最輕（P＜0.05）。光凝后14 d 與21 d，模型組熒光素滲漏最強(qiáng)，中藥組次之，西藥組滲漏強(qiáng)度弱于中藥組，聯(lián)合組滲漏強(qiáng)度最弱，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2、表3）。

表2 光凝后不同時(shí)間各組FFA 熒光素滲漏的AOD 值變化（，n=6）

表2 光凝后不同時(shí)間各組FFA 熒光素滲漏的AOD 值變化（，n=6）

注：※ 同時(shí)間段，與模型組比較，P＜0.05。# 同時(shí)間段，與中藥組比較，P＜0.05。& 同時(shí)間段，與西藥組比較，P＜0.05。* 同時(shí)間段，與聯(lián)合組比較，P＜0.05

表3 光凝后不同時(shí)間熒光素滲漏的AOD 值各組比較統(tǒng)計(jì)值

圖1 各組BN 大鼠眼底及血管造影圖。1A 空白組眼底彩照；1B 空白組FFA 圖像，可見血管充盈，未見熒光素滲漏；1C 模型組眼底彩照；1D模型組FFA 圖像，光凝斑處有熒光素滲漏；1E～1H 中藥組FFA 圖像，光凝斑處有熒光素滲漏，分別為7 d 組、14 d 組、21 d 組；1H 中藥組ICGA 圖像，CNV 呈花環(huán)狀充盈，7 d 組；1I～1L 西藥組FFA 圖像，光凝斑處有熒光素滲漏，分別為7 d 組、14 d 組、21 d 組；1L 西藥組ICGA 圖像，CNV 呈花環(huán)狀充盈，7 d 組；1M～1P 聯(lián)合治療組FFA 圖像，光凝斑處有熒光素滲漏，分別為7 d 組、14 d 組、21 d 組；1P 聯(lián)合治療組ICGA 圖像，CNV 呈花環(huán)狀充盈，7 d 組

2.4 組織病理學(xué)

模型組BN 大鼠光凝后7 d，CNV 開始形成，光凝后14 d CNV 中央厚度逐漸增加，21 d，CNV 逐漸纖維化。隨光凝后時(shí)間推移，模型組和各治療組CNV 中央厚度逐漸增加（P＜0.05）（表4、表5）。光凝后7 d，中藥組與模型組之間、西藥組與聯(lián)合組之間的CNV 中央厚度均無明顯差異（P＞0.05），但西藥組顯著低于模型組和中藥組（t模型組=7.79，t中藥組=7.05，均P=0.000）。而聯(lián)合組也顯著低于模型組和中藥組（t模型組=8.32，t中藥組=7.67，均P=0.000），均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 光凝后不同時(shí)間各組CNV 中央厚度變化（，n=6）

表4 光凝后不同時(shí)間各組CNV 中央厚度變化（，n=6）

注：※ 同時(shí)間段，與模型組比較，P＜0.05。# 同時(shí)間段，與中藥組比較，P＜0.05。& 同時(shí)間段，與西藥組比較，P＜0.05。* 同時(shí)間段，與聯(lián)合組比較，P＜0.05

表5 光凝后不同時(shí)間各組CNV 中央厚度比較統(tǒng)計(jì)值

光凝后14 d，各治療組CNV 中央厚度均低于模型組（t中藥組=6.79，t西藥組=10.00，t聯(lián)合組=12.20，均P=0.000），其中，中藥組與其他組比較（t西藥組=4.41,P=0.001；t聯(lián)合組=7.76，P=0.000），西藥組與聯(lián)合組比較（t=4.14，P=0.002），均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

光凝后21 d，各治療組CNV 中央厚度均低于模型組（t中藥組=6.89，t西藥組=11.34，t聯(lián)合組=15.95，均P=0.000），其中，中藥組與其他組比較（t西藥組=4.45，t聯(lián)合組=9.06，均P=0.000）,西藥組與聯(lián)合組比較（t=4.61，P=0.000），均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表4、表5，圖2）。

圖2 BN 大鼠視網(wǎng)膜組織病理學(xué)變化（×200）。2A～2C 分別為模型組7 d、14 d、21 d 組視網(wǎng)膜切片，紅箭頭所示為CNV 中央厚度；2D～2F 分別為中藥組7 d、14 d、21 d 組視網(wǎng)膜切片；2G、2H、2I 分別為西藥組7 d、14 d、21 d 組視網(wǎng)膜切片；2J～2L 分別為聯(lián)合組7 d、14 d、21 d 組視網(wǎng)膜切片

3 討論

實(shí)驗(yàn)性CNV 的形成機(jī)制包括氪激光的熱效應(yīng)、光化學(xué)效應(yīng)和機(jī)械損傷效應(yīng)，使局部組織溫度驟升、蛋白質(zhì)變性，導(dǎo)致組織損傷和細(xì)胞壞死[2]，RPE 層、Bruch’s 膜和脈絡(luò)膜損傷后，在局部產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，炎癥細(xì)胞分泌的多種生長因子和蛋白酶共同促進(jìn)了CNV 的形成[3]。光凝后早期，光凝處視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)紊亂，組織內(nèi)陷，外核層斷裂或缺損，內(nèi)核層向外層視網(wǎng)膜遷移，增殖細(xì)胞穿過破損的Bruch’s 膜和RPE 層向視網(wǎng)膜內(nèi)層浸潤，隨著纖維血管組織繼續(xù)生長，可見血管內(nèi)皮細(xì)胞圍成的管腔，偶見其內(nèi)的紅細(xì)胞，隨時(shí)間推移，纖維細(xì)胞逐漸增多，炎性細(xì)胞逐漸減少，CNV 趨向纖維化[4]。因此，氪激光誘導(dǎo)BN 大鼠建立的CNV 模型與人類以CNV 為病理特征的濕性AMD 有相同的細(xì)胞成分和相似的病理過程[5-6]。

本研究所用659 nm 氪激光，參數(shù)設(shè)置功率高達(dá)360 mW，光斑直徑小，曝光時(shí)間短。光凝后7 d，CNV開始形成，光凝后14 d，達(dá)到頂峰，21 d，CNV 逐漸穩(wěn)定，模型組CNV 發(fā)生率早期為77.08%，晚期高達(dá)89.58%，與以往研究相比模型成功率更高[7]。

血管模式機(jī)制認(rèn)為AMD 是一種以原發(fā)性脈絡(luò)膜血管灌注異常、伴有繼發(fā)性RPE 細(xì)胞損傷為特征的血管性病變[8]。隨年齡增加，會(huì)出現(xiàn)脈絡(luò)膜灌注降低與血管阻力增高，眼組織血供不足及血管流體靜壓升高，RPE 細(xì)胞不能及時(shí)清除光感受器細(xì)胞代謝脫落的外節(jié)盤膜，積存在Bruch’s 膜與RPE 層之間，遂形成玻璃膜疣、色素紊亂、地圖樣萎縮及Bruch’s 膜的鈣化與破裂。Bruch’s 膜與RPE 層之間累積的玻璃膜疣等脂類物質(zhì)，降低液壓傳導(dǎo)性，加重RPE 的功能障礙，形成惡性循環(huán)。升高的脈絡(luò)膜毛細(xì)血管壓、Bruch’s 膜斷裂、VEGF 共同作用促使CNV 形成[8]。

課題組認(rèn)為AMD 屬中醫(yī)眼科“瞳神絡(luò)病”的范疇[9-11]。廣義瞳神指瞳孔及其后部眼組織，又稱水輪，在臟屬腎，瞳神相關(guān)疾病多指視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜疾病。絡(luò)病理論是中醫(yī)理論體系的主要內(nèi)容之一，絡(luò)脈系統(tǒng)縱橫交錯(cuò)、遍布全身，是維持機(jī)體生理功能的重要結(jié)構(gòu)[12]。瞳神絡(luò)病可以是絡(luò)脈自身異常所形成的病變，也可以是臟腑氣血功能紊亂、久病入絡(luò)所形成的病變[9]。《靈樞·大惑論》云：“五臟六腑之精氣皆上注于目而為之精”，絡(luò)脈運(yùn)送五臟六腑之精氣上達(dá)于目，使氣血津液滲灌于目，同時(shí)，絡(luò)脈將目竅的代謝廢物清除運(yùn)走，使目竅發(fā)揮其視瞻功能。隨著年齡的增長，肝腎虧虛，氣血不足，目竅絡(luò)脈功能逐漸衰退，如同西醫(yī)所講的AMD 發(fā)病的血管模式機(jī)制，絡(luò)脈對目竅氣血滲灌不足，并且不能將代謝廢物及時(shí)清除，遂形成玻璃膜疣，玻璃膜疣在局部產(chǎn)生毒性反應(yīng)，加重絡(luò)脈功能障礙，“邪阻”目絡(luò)，形成“敗絡(luò)”。或者因年老肝腎虧虛，氣血生化乏源，絡(luò)脈氣血空虛，氣機(jī)郁結(jié)蘊(yùn)熱化火，灼傷目絡(luò)；又脾虛生濕，濕郁日久，煎熬成痰或瘀，痰濕“邪阻”（此處的瘀、痰、濕類似于西醫(yī)所講的在RPE 層與Bruch’s 膜之間積存的玻璃膜疣等脂類物質(zhì)），日久入絡(luò)，形成“敗絡(luò)”。亢澤峰教授認(rèn)為“邪阻”是瞳神眼病共同的發(fā)病環(huán)節(jié)，“敗絡(luò)”是“邪阻”的惡性轉(zhuǎn)化；“敗絡(luò)”則指絡(luò)脈本身的病變，或是在病變過程中新生成的異常絡(luò)脈[9]，相當(dāng)于濕性AMD 中血管灌注不足且流體靜壓增高的脈絡(luò)膜血管，以及CNV。因此可以認(rèn)為，“邪阻”“敗絡(luò)”“病絡(luò)”均是濕性AMD 病變中絡(luò)病的的病理過程與病機(jī)環(huán)節(jié)，最終導(dǎo)致“絡(luò)病”的發(fā)生。

因此，肝腎脾虛是濕性AMD 的發(fā)病基礎(chǔ)，陰虛火旺，氣血失調(diào)，目絡(luò)空虛，水濕停聚，氣虛血瘀和絡(luò)脈瘀滯是發(fā)病的主要病因病機(jī)，而邪阻目絡(luò)是發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。肝腎脾虛，氣血不足，目絡(luò)空虛，導(dǎo)致氣虛運(yùn)化失司，津液代謝失常，氣血失調(diào)，水濕停聚；久病傷脾，脾虛生濕，氣機(jī)不利，陽氣不升，濁氣不降，邪郁日久，化痰化熱化瘀，邪氣膠滯，阻塞目絡(luò)，導(dǎo)致“邪阻”目絡(luò)。血不養(yǎng)脈，日久則成病絡(luò)。絡(luò)脈瘀阻，瘀久生熱，灼傷脈絡(luò)，病絡(luò)受損，血溢絡(luò)外，出現(xiàn)視功能損害。

駐景丸加減方出自《中醫(yī)眼科六經(jīng)法要》一書，是眼科名方，廣泛用于治療“能近怯遠(yuǎn)、近覷”（病理性近視）、“視瞻昏渺”（AMD）等眼底病。以駐景丸加減方為基本方隨證加減，對新生血管性眼底病進(jìn)行大量臨床觀察和研究，經(jīng)過反復(fù)的推敲驗(yàn)證、優(yōu)化提煉形成固定方劑“加減駐景方”。通常用此方來治療AMD 和病理性近視等伴有CNV 的眼底疾病，并取得了確切的臨床療效，能夠明顯促進(jìn)出血、水腫吸收，改善患者主觀癥狀，如視疲勞、視物變形、眼前遮擋感等，并能穩(wěn)定病情，提高視力，減少復(fù)發(fā)[13]。實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)該方能有效地抑制CNV 的形成，抑制CNV 動(dòng)物模型中VEGF 的表達(dá)[14-15]。

清代名醫(yī)葉天士[16]有言：“久病必治絡(luò)—病久氣血推行不利，血絡(luò)之中必有瘀凝，故致病氣纏延不去，必疏其絡(luò)而病氣可盡也”。王清任[17]認(rèn)為：“元?dú)饧忍摚夭荒苓_(dá)于血管，血管無氣，必停留而瘀”。基于以上理論，課題組提出濕性AMD 的基本治法，即補(bǔ)腎明目、益氣活血、化瘀通絡(luò)，并以此為治則，組成了加減駐景方。認(rèn)為本病病機(jī)主要為肝腎不足，兼具氣血津液功能障礙，表現(xiàn)為瘀、痰、濕的本虛標(biāo)實(shí)證，治以補(bǔ)腎明目、活血通絡(luò)為要?jiǎng)t，輔以利水滲濕、止血活血、益氣養(yǎng)血、溫陽通絡(luò)之藥。

本實(shí)驗(yàn)研究顯示：中藥加減駐景方具有抑制CNV 滲漏和CNV 中央厚度增長的作用，加減駐景方對CNV 的抑制作用與康柏西普可能存在某種協(xié)同促進(jìn)作用。加減駐景方對實(shí)驗(yàn)性CNV 的抑制機(jī)制有待進(jìn)一步研究。