早期肺腺癌中TGF-β1、p53、E-cadherin的表達及其相關性

仲 林，關宏偉，張朋新，馮 璐，祁文靜

2011年肺腺癌多學科分類共識意見重新定義原位腺癌、微浸潤性腺癌和附壁生長為主型的浸潤性腺癌(lepidic predominant adenocarcinoma, LPA)的病理類型[1]。然而在臨床上的特殊組織學特征的不典型腺瘤樣增生(atypical adenomatous hyperplasia, AAH)及微浸潤性腺癌給病理醫師的診斷帶來較大困擾。因此，探討早期肺腺癌的分子生物學特征具有重要意義。轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)是多功能的細胞因子，在腫瘤發生、發展中具有重要作用[2]。p53是重要的抑癌基因，其功能喪失是惡性腫瘤發生的重要基礎[3]。E-cadherin是重要的黏附分子，是上皮-間質細胞轉化中的重要信號標志[4]。本文著重探討TGF-β1、p53、E-cadherin蛋白在早期肺腺癌中的表達及其相關性，為早期肺腺癌的臨床診斷、治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2012年9月～2013年12月大連醫科大學附屬第一醫院手術切除的肺部腫瘤標本97例，其中男性23例，女性74例，年齡48～76歲，平均(58.65±9.57)歲，腫瘤直徑5～20 cm，平均(8.82±4.38) cm。納入標準：(1)所有病理切片均經高年資病理醫師確診；(2)患者首次發病，臨床資料完整；(3)患者術前未行放、化療等，未服用免疫制劑。按2011年肺腺癌系統分類標準將其分為AAH 16例、原位腺癌33例、微浸潤性腺癌22例、LPA 26例。本實驗經我院倫理委員會同意，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法應用免疫組化MaxVision法對組織中TGF-β1、p53、E-cadherin蛋白表達水平進行檢測，免疫組化試劑盒購自福州邁新公司，鼠抗人TGF-β1、p53、E-cadherin多克隆抗體均購自北京中杉金橋公司。所有標本均4 μm厚連續切片，經二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，自來水沖洗，PBS清洗，高溫高壓抗原修復，3%過氧化氫甲醇消化內源性過氧化物酶，加入山羊血清進行封閉，滴加生物學一抗，室溫孵育60 min，PBS清洗，滴加生物學二抗，室溫孵育15 min，PBS清洗，DAB顯色、蘇木精復染、梯度乙醇脫水，制片封閉等。以PBS代替一抗作為陰性對照，以試劑盒說明書提供樣本作為陽性對照，鏡下觀察。

1.3 結果判定TGF-β1陽性定位于細胞質，p53陽性定位于細胞核，E-cadherin陽性定位于細胞膜，根據細胞染色強度和陽性細胞百分數計分[5]。(1)按細胞染色強度計分：未著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分；(2)按陽性細胞百分數計分：無陽性細胞為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分；將兩項得分結果相乘：總分≤3分為(-)，>3分為(+)。

2 結果

2.1 AAH、原位腺癌、微浸潤性腺癌及LPA中TGF-β1、p53、E-cadherin的表達在早期肺腺癌中隨組織病理學分級增高TGF-β1、p53蛋白陽性率升高，E-cadherin蛋白陽性率降低，TGF-β1、p53、E-cadherin在AAH、原位腺癌、微浸潤性腺癌及LPA中的陽性率差異均有統計學意義(P<0.05，表1)。

2.2 微浸潤性腺癌、LPA中浸潤成分和非浸潤成分TGF-β1、p53、E-cadherin的表達在微浸潤性腺癌及LPA浸潤成分中TGF-β1、p53陽性率高于非浸潤成分，E-cadherin陽性率低于非浸潤成分(P<0.05，表2、3，圖1～6)。

①②③④⑤⑥

表1 AAH、原位腺癌、微浸潤性腺癌及LPA中TGF-β1、p53、E-cadherin的表達[n(%)]

表2 微浸潤性腺癌中浸潤成分和非浸潤成分中TGF-β1、p53、E-cadherin的表達[n(%)]

表3 LPA中浸潤成分和非浸潤成分TGF-β1、p53、E-cadherin的表達[n(%)]

2.3 早期肺腺癌中TGF-β1、p53、E-cadherin表達的相關性Spearman相關分析顯示，在AAH、原位腺癌中TGF-β1與E-cadherin表達呈負相關(rs=-0.673，rs=-0.608，P=0.008，P=0.012)；在微浸潤性腺癌和LPA非浸潤成分中TGF-β1與E-cadherin表達呈負相關(rs=-0.508，rs=-0.467，P=0.017,P=0.022)。

3 討論

目前，對肺腺癌多學科分類共識意見中形態學改變和分子生物學指標的研究十分有限。本實驗對各組TGF-β1、p53、E-cadherin蛋白表達進行分析。TGF-β1在調控細胞增殖、分化、凋亡和組織修復中起重要作用[6]。Sakai等[7]報道顯示，在非小細胞肺癌患者中TNM分期較晚的患者血清TGF-β1水平較高，預后較差。石丹等[8]報道TGF-β1高表達可以增加肺癌細胞的遷移能力，腫瘤浸潤性較高。本實驗結果顯示，在早期肺腺癌中隨著組織病理學分級增高TGF-β1蛋白陽性率升高，與Sakai等報道相符。

本實驗結果顯示，在微浸潤性腺癌及LPA非浸潤成分中TGF-β1陽性率也高于AAH、原位腺癌，提示TGF-β1上調可能早于形態學中腫瘤細胞浸潤和破壞肺泡壁。p53是重要的抑癌基因，對細胞分裂起監控作用[9]。當p53基因發生突變后可以導致細胞惡變。本實驗p53蛋白隨組織病理學分級增高，其陽性率升高；在微浸潤性腺癌及LPA中浸潤成分p53陽性率顯著高于非浸潤成分,提示p53突變蛋白參與原位腺癌發展為微浸潤性腺癌的過程，同時p53突變也促進早期肺腺癌的浸潤過程。E-cadherin是上皮細胞間的黏附分子，可保持上皮細胞間的同質黏附作用。研究發現，在胃癌、乳腺癌中存在E-cadherin的低表達[10]。本實驗結果顯示，在早期肺腺癌中E-cadherin蛋白隨組織病理學分級的增高，其陽性率降低；在微浸潤性腺癌及LPA的浸潤成分中E-cadherin陽性率低于非浸潤成分。推測E-cadherin表達下調導致細胞間連接降低，肺上皮細胞發生癌變，并促進癌細胞浸潤。通過相關性分析，作者認為TGF-β1與E-cadherin可能存在共同的調控通路，促進早期肺腺癌的發生、發展，其確切關系有待于進一步研究證實。臨床通過對早期肺腺癌TGF-β1、p53、E-cadherin的檢測，也可以為肺腺癌的分型、預后判斷提供依據。

綜上所述，早期肺腺癌中TGF-β1、p53蛋白隨組織病理學分級增高，其陽性率升高；而E-cadherin蛋白陽性率降低，在微浸潤性腺癌及LPA浸潤成分中TGF-β1、p53陽性率高于非浸潤成分，E-cadherin陽性率低于非浸潤成分，三者參與早期肺腺癌的發生和浸潤。