基于公共數據庫分析PEG3基因在肺腺癌中的表達及預后意義

（中國醫科大學附屬第一醫院放療科，沈陽 110001）

近年來，肺癌的發病率及死亡率均呈逐漸上升趨勢，是癌癥死亡的首要原因。非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌的80%左右，其中腺癌是NSCLC中常見的病理類型，早期易發生血行轉移，盡管目前針對肺腺癌的治療手段較多，但其5年生存率仍不理想［1］。

PEG3基因編碼kruppel C2H2型鋅指蛋白，其轉錄本可編碼1572個氨基酸序列［2］。PEG3蛋白參與Wnt［3］、p53［4］、NF-κB［5］等多條信號通路，調控調亡［4］、自噬［6］等重要生物學過程，在腫瘤研究中PEG3基因作為抑癌基因，被證實在子宮頸癌［7］及膠質瘤［3］中能抑制腫瘤的生長。

PEG3作為人類的印跡基因，位于染色體19q13.43上［2］。由于PEG3基因包含一些非編碼區域，目前有多個研究［8-9］探討了與PEG3相關的非編碼RNA。但PEG3在肺腺癌中是否發揮作用，及其與肺腺癌發生、發展的關系，目前尚無相關研究。本研究通過公共數據庫分析PEG3基因在肺腺癌中的表達及其對預后的影響，為進一步研究PEG3在肺腺癌發生發展過程中的作用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 TIMER和人類蛋白質圖譜數據庫

應用TIMER 數據庫［10］（www.cistrome.shinyapps.io/timer）分析PEG3在TCGA肺腺癌數據庫中的mRNA表達情況。人類蛋白質表達圖譜（THE HUMAN PROTEIN ATLAS，www.proteinatlas.org）分析PEG3在肺癌TCGA數據庫中的預后情況。

1.2 Kaplan-Meier曲線數據庫

應用Kaplan-Meier曲線（Kaplan-Meier Plotter，www.kmplot.com）數據庫網站分析PEG3在肺腺癌數據庫中的預后情況。

1.3 LinkedOmics公共網站

應用LinkedOmics公共網站［11］（www.linkedomics.org/login.php）中的LinkFinder模塊分析PEG3表達與肺腺癌臨床病理特征的關系，TCGA中運用HiSeqRNA平臺的RNAseq數據，分析PEG3mRNA的表達水平與肺腺癌臨床病理特征的關系。

1.4 MethHC數據庫

應用MethHC數據庫［12］分析PEG3基因在正常肺組織和肺腺癌組織中的甲基化模式，并分析甲基化和表達之間的關系。

1.5 TargetScanHuman數據庫

應用TargetScanHuman數據庫［13］（www.targetscan.org）2018年3月在線的7.2版本在線分析PEG3相關的微小RNA（microRNA，miRNA）。

1.6 STRING數據庫

采用STRING數據庫（www.string-db.org/）對PEG3基因進行蛋白相互作用的網絡分析。

1.7 統計學分析

肺腺癌與正常肺組織中PEG3基因的表達差異采用t檢驗。PEG3基因表達與患者預后的關系采用Kaplan-Meier模型進行生存分析。采用在線統計學分析數據，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PEG3 mRNA在肺腺癌及正常肺組織中的表達情況

通過TCGA數據庫分析PEG3mRNA在肺腺癌的表達情況，其中包括肺腺癌組織483例，正常肺組織347例。結果顯示，與正常肺組織相比，PEG3mRNA在肺腺癌中表達顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.001，圖1A）。

圖1 TCGA數據庫中肺腺癌PEG3 mRNA表達水平及預后分析Fig.1 PEG3 mRNA expression and prognosis data of lung adenocarcinoma patients from the TCGA database

2.2 PEG3 mRNA表達與肺腺癌預后的關系

與PEG3mRNA高表達（n=220）的肺腺癌相比，PEG3mRNA低表達（n=280）的肺腺癌患者總生存率明顯提高，5年生存率分別為49%和35%，差異有統計學意義（P=0.002 2，圖1B）。為進一步驗證其預后意義，通過Kaplan-Meier Plotter在線網站再次分析其在肺腺癌組織中高低表達與肺腺癌患者預后的相關性。結果發現，PEG3mRNA的表達情況與總生存率明顯有關，高表達組的死亡風險較低表達組有下降趨勢（HR=0.3，95%CI：0.21～0.43，P＜0.001，圖2）。與TCGA肺腺癌數據庫中的結果一致。

圖2 Kaplan-Meier Plotter 肺腺癌PEG3表達的總體生存期曲線Fig.2 The overall survival curves of lung adenocarcinoma patients with high and low PEG3 mRNA levels generated using Kaplan-Meier Plotter

2.3 PEG3 mRNA表達與肺腺癌臨床病理特征的關系

通過LinkedOmics在線分析PEG3mRNA與肺腺癌臨床病理特征的關系，結果發現，PEG3的表達僅與腫瘤T分期有相關性（P＜0.005，圖3）；與N分期（P=0.06）、M分期（P=0.24）、病理分級（P=0.07）和種族（P=0.25）不相關。

圖3 PEG3 mRNA表達與肺腺癌T分期的關系Fig.3 Correlation between the PEG3 mRNA expression and T staging of lung adenocarcinoma

2.4 PEG3啟動子區DNA甲基化水平分析

在MethHC數據庫中，PEG3有NM_001146184、NM_001146185、NM_001146186、NM_001146187、NM_006210共5個轉錄模板。其中，NM_001146184、NM_001146185、NM_001146187、NM_006210在肺腺癌中甲基化水平均較正常肺組織高（P＜0.005）。以NM_001146184為例，肺腺癌中PEG3基因啟動子區甲基化水平較正常組織顯著升高。見圖4。

圖4 PEG3基因NM_001146184 轉錄本在肺腺癌和正常組織中甲基化情況Fig.4 The methylation level of PEG3（NM_001146184）transcript in lung adenocarcinoma and normal lung tissues

2.5 PEG3基因相關的miRNA預測

TargetScanHuman數據庫預測結果顯示，miR-124-3p.2/506-3p、miR-124-3p.1、miR-9-5p、miR-221-3p/222-3p、miR-141-3p/200a-3p和miR-155-5p可能與PEG3相關。見圖5。

2.6 PEG3蛋白相互作用網絡

圖5 TargetScanHuman分析PEG3相關的miRNAFig.5 TargetScanHuman analysis of PEG3-related miRNA

在STRING網站中選擇物種為人類，置信度選擇為0.400，相互作用最大數選擇60（圖6）。PEG3的作用蛋白包括TP53和BECLIN1，均是影響凋亡及自噬的關鍵蛋白。GO富集分析發現PEG3主要參與蛋白印記、調控染色質構型、發育進程、細胞周期、甲基化和凋亡等。

圖6 STRING分析PEG3相互作用的蛋白Fig.6 STRING analysis of PEG3-related proteins

3 討論

肺腺癌是肺癌常見的病理分型之一，目前對于其治療方式的研究比較廣泛。盡管針對肺腺癌的放化療和靶向治療取得了一些成果，但在早期診斷肺腺癌及預后分子靶標等方面，還需要進一步的探索。

本文探討了PEG3在肺腺癌中的表達及對于預后的影響。首先通過對TCGA數據庫的分析，比較了PEG3在肺腺癌和正常肺組織中的表達差異，發現PEG3在肺腺癌中呈顯著低表達。其次，應用TIMER分析TCGA數據庫中PEG3表達高低對肺腺癌預后不同影響，結果顯示PEG3的表達水平越低，其預后較差。在乳腺癌中，BURASCHI等［14］通過數據分析發現PEG3呈現出低表達的情況。陳展等［15］也在mRNA水平上發現了PEG3在腎透明細胞癌中較正常腎組織顯著低表達，并且其表達水平與腎癌預后呈負相關。但DENIZ等［16］在睪丸生殖細胞腫瘤中卻得到了相反的結論，發現PEG3在該腫瘤中呈現高表達狀態。有研究［17］發現PEG3在胚胎系腫瘤中呈現出高表達狀態，而在非胚胎性腫瘤中表達相對較低。

PEG3基因是1996年KUROIWA等［18］通過母系和父系二體胚胎的研究所發現的印跡基因之一。PEG3基因被鑒定為鋅指基因之一，位于人類染色體19q13.4區域中［2］。隨著研究的不斷深入，PEG3被發現參與了多條人體重要信號通路，包括Wnt［3］、p53［4］、NF-κB［5］及自噬［6］等。PEG3可以通過Siah1、Bax從胞漿向線粒體的移位以及對Wnt信號通路的抑制［3］，誘導p53介導的細胞凋亡［4］，提示其具有促凋亡作用。相反，還有研究［5］發現PEG3還可以通過TRAF2激活NF-κB，保護細胞免受凋亡影響。PEG3也是內皮細胞自噬過程中轉錄因子EB的上游調控因子［6］。

有研究［7，19］發現，PEG3基因通常在腫瘤細胞系和腫瘤中表達減少或者缺失的原因是存在啟動子的甲基化以及丟失雜合性。本研究中發現，相對于正常組織，PEG3在肺腺癌組織中的甲基化水平很高。同樣在膠質瘤細胞株［19］、乳腺癌［20］和子宮頸癌［7］中均存在這種因甲基化造成PEG3表達的影響。另外富集分析進一步發現PEG3參與甲基化的過程。當DNA甲基化后雖然核苷酸順序沒有改變，但是卻可能導致染色體的結構發生改變，也有可能通過關閉抑癌基因，進而導致腫瘤發生。目前已有多種DNA去甲基化作用的化合物藥物被開發，這些藥物可重新激活高甲基化的腫瘤抑制基因，并陸續進入臨床試驗［21］。PEG3或許是去甲基化的新靶點。

另外，非編碼RNA也可能進一步影響PEG3的表達，甚至對其功能造成影響。目前發現PEG3基因區一個214核苷酸長的環狀RNA-circPeg3，提示該環狀RNA也可能進一步影響PEG3這一印跡基因的作用及相關調控，但仍需要進一步的實驗探索［8］。在睪丸生殖細胞腫瘤中發現miR-514a-3p通過調控PEG3從而激活NF-κB通路［16］。通過TargetScanHuman在線分析了PEG3相關的miRNA，發現了miR-506等多個相關miRNA，也為進一步研究PEG3與非編碼RNA的關系，提供了相應的理論基礎。

綜上所述，本研究通過對公共數據庫中肺腺癌相關數據的挖掘，發現PEG3在肺腺癌組織中低表達，PEG3高表達的肺腺癌患者預后好于PEG3低表達的肺癌患者，研究結果為肺腺癌患者的預后指標的篩選提供了一定的理論基礎，未來仍需更多的基礎研究對其具體分子機制進行深入探討。