氟伐他汀鈉對皮膚鱗狀細胞癌細胞增殖、凋亡及PI3K/AKT/mTOR通路的影響

（中國醫科大學附屬第一醫院皮膚科，沈陽 110001）

皮膚鱗狀細胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma，CSCC）是世界上第二常見的皮膚癌，發病率不斷升高［1］。近年來，我國CSCC的發病率也逐年升高，發病年齡呈現年輕化趨勢。CSCC嚴重影響患者的生活質量，給患者帶來了沉重的身心負擔［2］。他汀類是治療中老年人群高脂血癥的常用藥物。近年來，隨著他汀類藥物的廣泛應用和對其作用機制的深入研究，其抗腫瘤的作用受到廣泛關注［3-4］。在肺癌［5］、肝癌［6］、結直腸癌［7］、乳腺癌［8］等方面相關研究取得了一定進展，但他汀類藥物在皮膚腫瘤方面的研究國內鮮有報道。本研究以培養的人CSCC SCL-1細胞為研究對象，觀察氟伐他汀鈉對SCL-1細胞的增殖、凋亡的影響，并探討其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

人CSCC細胞株 SCL-1由德國柏林自由大學本杰明·富蘭克林醫學中心惠贈。主要試劑包括氟伐他汀鈉（上海源葉生物科技有限公司）、DMEM細胞培養液（美國Hyclone公司）、胎牛血清（美國Bioscience公司）、噻唑藍（北京索萊寶公司）、二甲基亞砜（美國Sigma公司）、Annexin V/PI凋亡試劑盒（上海優寧維有限公司）、Trizol試劑（美國Invitrogen公司）、反轉錄試劑盒（日本Toyobo公司）、實時qPCR試劑盒（日本Toyobo公司）。

1.2 方法

1.2.1 氟伐他汀鈉儲存液及工作液配制：用DMSO將氟伐他汀鈉充分溶解，配制成800 μmol/L濃度的母液（DMSO 終濃度≤0.01%），22 μm濾器過濾，4 ℃避光保存；用含10%胎牛血清的DMEM培養液稀釋成含氟伐他汀鈉10、20、50、100 μmol/L的工作液。

1.2.2 細胞培養：將 SCL-1細胞培養于含10% 胎牛血清的DMEM培養液中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱中。觀察培養基清亮，細胞呈貼壁生長，形態良好，細胞鋪滿瓶壁 70%～80%可以傳代。

1.2.3 MTT檢測細胞增殖抑制率：收集處于對數生長期的SCL-1細胞，以5×104/mL的細胞密度接種于96孔板。每孔加入100 μL細胞懸液，繼續培養24 h；吸去96孔板中的培養液，實驗組分別加入10、20、50、100 μmol/L工作液；設空白組（只加入培養液無細胞）和對照組（加入與實驗組等量培養基），每組各設 6個復孔。置于5%CO2、37 ℃培養箱中繼續培養24、48、72 h。在預定時間前4 h以MTT法在酶聯免疫檢測儀上測定各孔的吸光度（optical density，OD），實驗重復3次。細胞增殖抑制率=（1-OD實驗組/ OD對照組）×100%。

1.2.4 流式細胞術Annexin V-FITC/PI雙標記檢測細胞凋亡：收集處于對數生長期的SCL-1細胞，分別加入10、20、50、100 μmol/L的氟伐他汀鈉培養24 h、48 h后離心收集細胞。用400 μL 1×結合緩沖液使細胞懸浮，調整細胞濃度約為1×106/mL，1 000 r/min離心5 min，沉淀細胞，孵育緩沖液洗1次，加入5 μL AnnexinV-FITC，混勻后于2～8 ℃避光孵育15 min。加入10 μLPI混勻后2～8 ℃ 避光孵育5 min，在1 h內流式細胞儀檢測細胞凋亡率。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，以左下象限顯示活細胞，為（FITC-/PI-）；右上象限為非活細胞，即晚期凋亡細胞和死細胞，為（FITC+/PI+）；右下象限表示早期凋亡細胞，顯現（FITC+/PI-）。實驗重復3次，統計早期凋亡率。

1.2.5 實時qPCR法檢測磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol-3 kinases，PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）、雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）mRNA相對表達量：將細胞生長狀態良好的SCL-1細胞接種于6孔板內并培養過夜，分別加入10、20、50、100 μmol/L的氟伐他汀鈉培養24 h，按照Trizol試劑說明書的方法行總RNA提取，采用分光光度計檢測RNA質量。使用反轉錄試劑盒將RNA轉錄為cDNA，而后使用實時qPCR試劑盒進行擴增，擴增基因包括PI3K、AKT、mTOR，內參基因為GAPDH，根據Genebank公布的序列，采用Oligo6設計所需引物，引物序列見表1。以空白對照組的表達量定義為1，采用2-△△Ct法進行相對定量，實驗重復3次。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 氟伐他汀鈉對SCL-1細胞增殖的影響

結果顯示，用10、20、50、100 μmol/L氟伐他汀鈉干預SCL-1細胞后，相同時間隨著氟伐他汀鈉濃度增加SCL-1細胞抑制率上升（P＜0.01）；同濃度氟伐他汀鈉對SCL-1細胞分別干預24、48、72 h后，細胞增殖的抑制率隨干預時間增加而上升（P＜0.01），見表2。氟伐他汀鈉在48 h對SCL-1的IC50為10.70 μmol/L。

2.2 氟伐他汀鈉對SCL-1細胞早期凋亡的影響

結果顯示，不同濃度處理SCL-1細胞早期凋亡率隨氟伐他汀鈉的濃度增加而上升，呈現濃度依賴性（P＜0.01）；相同濃度下，48 h早期凋亡率高于24 h，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表3，圖1、2。

表2 不同濃度氟伐他汀鈉作用下SCL-1細胞抑制率（%）Tab.2 Inhibition rate of SCL-1 cells treated with different concentrations of fluvastatin sodium（%）

2.3 不同濃度氟伐他汀鈉對PI3K、Akt、mTOR mRNA表達的影響

結果顯示，不同濃度的氟伐他汀鈉培養SCL-1細胞24 h后PI3K、AKT、mTORmRNA相對表達量隨著藥物濃度的升高而降低（P＜0.01）。見表4。

表3 不同濃度氟伐他汀鈉作用下SCL-1細胞早期凋亡率（%）Tab.3 Early apoptotic rate of SCL-1 cells treated with different concentrations of fluvastatin sodium（%）

圖1 各組24 h 時Annexin V-FITC/PI 雙染流式細胞分析散點圖Fig.1 Annexin V-FITC/PI double staining flow cytometry scatter plots of SCL-1 cells after 24 h treatment with different concentrations of fluvastatin sodium

圖2 各組48 h時 Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞分析散點圖Fig.2 Annexin V-FITC/PI double staining flow cytometry scatter plots of SCL-1 cells after 48 h treatment with different concentrations of fluvastatin sodium

3 討論

他汀類藥物是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy3-methylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA）還原酶具有高度專一性的競爭性強力抑制劑。自20世紀80年代問世以來，普遍應用于臨床高脂血癥的治療［9-10］。HMG-CoA參與甲羥戊酸代謝途徑，他汀類藥物作為該酶的抑制劑抑制了甲羥戊酸以及下游產物的生成，從而抑制腫瘤細胞的生長、侵襲、轉移、細胞增殖和分化，調控細胞周期［11-12］。他汀類藥物能發揮多效細胞作用，其潛在機制包括：（1）洛伐他汀在SCC9、SCC25細胞系中可以損害線粒體功能并降低細胞ADP/ATP比率，觸發了LKB1/AMPK通路活化，從而影響腫瘤蛋白的翻譯［13］；（2）Hippo通路是一條經典的致癌通路，TAZ是該通路的下游效應物，有研究［14］發現他汀類對TAZ高表達的肝癌細胞具有抗增殖和誘導凋亡作用；（3）辛伐他汀抑制了DNA與NF-κB轉錄因子結合，抑制抗凋亡蛋白BCLXL表達，增加PTEN轉錄，從而發揮誘導細胞凋亡的作用［15］。

表4 24 h時不同濃度氟伐他汀鈉作用下SCL-1細胞PI3K、AKT、mTOR mRNA相對表達量（%）Tab.4 Relative mRNA expression levels of PI3K，AKT，and mTOR after 24 h treatment of SCL-1 cells with different concentrations of fluvastatin sodium

CSCC是一種常見的皮膚腫瘤，治療方式多樣，其中以手術切除為佳。然而由于手術治療易引起組織缺損且容易留下瘢痕，又因局部外用藥物及放射治療方法存在局限性，較易復發，臨床應用受限［16］。因此探尋新的治療藥物來抑制CSCC的發生發展具有很高的臨床價值。他汀類藥物在多種腫瘤中表現了顯著的生物學效應，本研究采用了臨床常用的氟伐他汀鈉處理SCL-1細胞，實驗結果表明氟伐他汀鈉以濃度依賴性和時間依賴性的方式抑制SCL-1細胞增殖。流式細胞術Annexin V-FITC/PI雙標法結果顯示氟伐他汀鈉的濃度越高、作用時間越長，SCL-1細胞凋亡率越高，由此可推測氟伐他汀鈉可以抑制SCL-1細胞的增殖，促進其凋亡。

PI3K介導的Akt/mTOR通路是一條經典的促存活和抗凋亡的信號轉導通路，在上皮源性惡性腫瘤的發生、發展、轉歸中具有重要作用［17］。本研究在明確氟伐他汀鈉能夠誘導SCL-1凋亡后，進一步對可能發揮作用的分子機制進行分析，結果顯示，氟伐他汀鈉可以降低PI3K、AKT、mTORmRNA相對表達量，且隨著藥物濃度的增加抑制作用明顯增強。這表明氟伐他汀鈉可以抑制SCL-1細胞內PI3K/Akt/mTOR通路。

綜上所述，氟伐他汀鈉具有抑制人CSCC增殖并誘導其凋亡的作用，推測其機制之一可能與抑制PI3K/Akt/mTOR通路有關，本研究為CSCC的藥物治療開拓了新的方向。