長鏈非編碼RNA RUNX1-IT1對口腔鱗狀細胞癌增殖、遷移的影響及其作用機制

王雪，李琳，張紅，張雪，王振華

（中國醫(yī)科大學 1.生命科學學院生理學教研室，沈陽 110122；2.附屬口腔醫(yī)院干診科，沈陽 110002）

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是具有高轉移率和高復發(fā)率的惡性腫瘤，約占口腔癌的90%［1］。目前手術仍為主要治療方式，但患者術后易發(fā)生轉移和復發(fā)，5年生存率僅為50%［2］。因此，尋找OSCC的發(fā)病和轉移機制十分重要。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一種沒有編碼蛋白能力的RNA。越來越多的證據表明lncRNA在OSCC的進展中發(fā)揮調控作用［3-5］。lncRNA RUNX1-IT1位于染色體21q22.12區(qū)域，長約1 502個核苷酸，研究［6-7］表明它在結直腸癌和胃癌中發(fā)揮調控作用，然而lncRNA RUNX1-IT1在OSCC中的功能和機制尚未明確。本研究通過體外實驗探討lncRNA RUNX1-IT1對OSCC增殖、遷移的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源：收集2018年5月至2019年2月期間中國醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院頜面外科手術切除的47例OSCC癌組織和癌旁正常組織，OSCC的診斷依據組織病理學確定。標本收集前經中國醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院倫理委員會批準，并經患者知情同意。

1.1.2 細胞培養(yǎng)：OSCC細胞系CAL27、SCC25均購于美國ATCC細胞庫。HaCaT購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心細胞庫。CAL27、HaCaT以DMEM高糖培養(yǎng)基（含有10%的胎牛血清）培養(yǎng)，SCC25以DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)液中加入10%胎牛血清，400 ng/mL氫化可的松，0.5 mmol/mL丙酮酸鈉。細胞于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 實時qPCR：用Trizol法提取組織和細胞RNA。采用PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒進行反轉錄。利用SYBRPremix Ex Taq Ⅱ在LightCycler480Ⅱ實時 PCR儀上進行實時定量PCR反應。引物序列：lncRNA RUNX1-IT1，上游引物5’-GGACACGCAGAGGAAGT CAA-3’，下游引物5’-GTTCTTGAGGTTGGCGGAGA-3’；GAPDH，上游引物5’-CGGATTTGGTCGTATTGGG-3’，下游引物5’-CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3’。以2-ΔΔCt法計算結果。

1.2.2 載體構建和細胞轉染：過表達慢病毒載體購于上海吉瑪基因公司，當CAL27細胞密度達到70%～80%時進行轉染。取CAL27分為LV5組（對照組）和LV-RUNX1-IT1組（實驗組），用1 μg/mL嘌呤霉素構建穩(wěn)定細胞系。SiRNA 購于廣州銳博公司，采用Lipofectamine 2000進行轉染。轉染空白載體細胞為si-NC組，轉染lncRNA RUNX1-IT1沉默載體細胞為si-RUNX1-IT1組。

1.2.3 細胞增殖：細胞增殖能力用CCK8檢測。常規(guī)胰酶消化細胞后在96孔板內接種100 μL對照組和實驗組細胞懸液，含2 000個細胞。在37 ℃孵箱內孵育24、48、72、96 h。每孔加入10 μL CCK8試劑孵育1 h，在450 nm波長處測定吸光度。

1.2.4 細胞周期：細胞消化后用PBS洗滌細胞（2 000 r/min，5 min）并收集，加入70%冷乙醇固定4 ℃過夜。根據細胞周期試劑盒說明書加入500 μL PI/RNaseA染色，室溫避光30～60 min后流式細胞儀采集數據并分析。

1.2.5 Transwell實驗：向Transwell小室上方加入含1×105個細胞的200 μL無血清培養(yǎng)基，下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，37 ℃孵育48 h。棄掉培養(yǎng)基，將上室置于甲醇固定1 min，蘇木素染色3 min和伊紅染色15～30 s。倒置顯微鏡隨機取圖并計數。

1.2.6 Western blotting：采用全蛋白試劑盒提取細胞總蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳后，常規(guī)轉膜。加入一抗（E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、Vimentin、PCNA、Cyclin D1、MMP2、β-actin）孵育4 ℃過夜，然后加入二抗，孵育1.5 h。利用凝膠成像儀采集圖像。

1.3 統(tǒng)計學分析

運用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數據分析。采用非參數檢驗方法分析lncRNA RUNX1-IT1表達水平和OSCC患者臨床病理資料的相關性。計量資料以表示，2組比較采用配對t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 lncRNA RUNX1-IT1在OSCC 中的表達

利用實時qPCR檢測47例OSCC患者lncRNA RUNX1-IT1的表達，結果顯示，38例（81%）OSCC癌組織lncRNA RUNX1-IT1表達（6.03±2.73）顯著高于癌旁正常組織（7.04±2.75，P＜0.001）。lncRNA RUNX1-IT1在OSCC細胞系CAL27（13.19±0.92）、SCC25（8.55±1.17）表達顯著高于正常細胞系HaCaT（1.00±0.00，P＜0.01）。lncRNA RUNX1-IT1相對表達水平和淋巴結轉移相關（P＜0.05），見表1。這些結果說明lncRNA RUNX1-IT1的高表達可能在OSCC轉移過程中發(fā)揮重要作用。

2.2 lncRNA RUNX1-IT1對CAL27細胞增殖的影響

過表達和沉默lncRNA RUNX1-IT1后實時qPCR檢測轉染效率。結果顯示，與LV5組（1.00±0.00）比較，LV-RUNX1-IT1組（48.44±7.33）中l(wèi)ncRNA RUNX1-IT1表達水平顯著增高（P＜0.01）；與si-NC組（1.00±0.00）比較，si-RUNX1-IT1組（0.24±0.06）lncRNA RUNX1-IT1表達水平顯著降低（P＜0.01）。

表1 lncRNA RUNX1-IT1表達和OSCC患者臨床指標的相關分析Tab.1 Correlation between lncRNA RUNX1-IT1 expression and clinicopathological characteristics in OSCC patients

CCK8實驗結果顯示，與LV5組比較，LV-RUNX1-IT1組在72、96 h OD值明顯增高（P＜0.05），細胞增殖活性顯著增強（圖1A）；lncRNA RUNX1-IT1沉默后，si-RUNX1-IT1組在72、96 h OD值明顯降低（P＜0.05），細胞增殖活性顯著減弱（圖1B）。

圖1 lncRNA RUNX1-IT1對CAL27細胞增殖的影響Fig.1 Effect of CAL27 cell proliferation on lncRNA RUNX1-IT1

流式細胞術檢測結果顯示，與LV5組比較，LVRUNX1-IT1組G1期細胞顯著減少，S期細胞顯著增加；而沉默lncRNA RUNX1-IT1后細胞阻滯在G1期，G1期細胞顯著增加，S期細胞顯著減少，見圖2。

2.3 lncRNA RUNX1-IT1對CAL27細胞遷移的影響

Transwell結果顯示，LV5組、LV-RUNX1-IT1組、si-NC組、si-RUNX1-IT1組細胞遷移數量分別為110±14、214±10、109±9、54±5。與LV5組比較，LVRUNX1-IT1組CAL27細胞遷移數量增多（P＜0.01），提示過表達lncRNA RUNX1-IT1后細胞遷移能力顯著增強；與si-NC組比較，si-RUNX1-IT1組CAL27細胞遷移數量顯著減少（P＜0.01），提示沉默lncRNA RUNX1-IT1后細胞遷移能力顯著減弱，見圖3。

圖2 流式細胞術細胞周期分析結果Fig.2 Results of cell cycle analysis by flow cytometry

圖3 lncRNA RUNX1-IT1對CAL27細胞遷移的影響×200Fig.3 Effect of CAL27 cell migration on lncRNA RUNX1-IT1 ×200

2.4 過表達的lncRNA RUNX1-IT1促進CAL27細胞上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）

Western blotting檢測EMT相關標志物結果顯示，過表達lncRNA RUNX1-IT1后，與LV5組比較，LV-RUNX1-IT1組上皮標志物E-cadherin顯著減少（P＜0.01），而間充質標志物N-cadherin、β-catenin、Vimentin（均P＜0.05）顯著增多，促進了上皮細胞向間質細胞轉換；沉默lncRNA RUNX1-IT1后發(fā)現結果與之相反，抑制了上皮細胞向間質細胞轉化。PCNA、Cyclin D1和MMP2蛋白水平均在lncRNA RUNX1-IT1過表達后顯著上調；在lncRNA RUNX1-IT1沉默后顯著下調。以上結果表明lncRNA RUNX1-IT1可能通過調控EMT促進CAL27細胞增殖和遷移，見表2、圖4。

3 討論

近年來，研究［8-10］表明，lncRNA的異常表達可能與癌癥（胃癌、卵巢癌和乳腺癌等）的預后和轉移相關。本研究結果顯示lncRNA RUNX1-IT1在OSCC組織和細胞中高表達，lncRNA RUNX1-IT1的表達和淋巴結轉移顯著相關，這說明lncRNA RUNX1-IT1高表達可能參與OSCC的轉移過程。

表2 各組EMT相關蛋白表達比較Tab.2 EMT-related proteins expression levels in all groups

圖4 各組EMT相關蛋白表達結果Fig.4 Expression of EMT-related proteins in all groups

已有研究［11］顯示，lncRNA生長特異抑制物5（growth arrest-specific 5，GAS5）過表達通過激活PTEN/AKT軸抑制OSCC細胞的增殖和侵襲。lncRNA母系表達基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）吸附miR-548d-3p調節(jié)JAK-STAT通路抑制OSCC的遷移并促進凋亡［12］。本研究結果發(fā)現過表達lncRNA RUNX1-IT1促進CAL27細胞的增殖和遷移，加快細胞從G1期向S期分化；而沉默lncRNA RUNX1-IT1抑制CAL27細胞的增殖和遷移，使細胞阻滯在G1期。

已有研究［13］認為EMT是細胞骨架重組、上皮細胞逐漸向間質細胞轉化的過程，其特點在于細胞形態(tài)學的變化。在這個過程中，上皮標志物（E-cadherin）減少而間充質標志物（N-cadherin、Vimentin）增加，使細胞具有更強的遷移和運動能力。轉錄因子Snail可以誘導EMT的發(fā)生，通過降解MMP2和介導靶基因Cyclin D1轉錄，調節(jié)膀胱癌細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移［14］。lncRNA肝癌高表達轉錄本（highly upregulated in liver cancer，HULC）在OSCC中高表達，敲除HULC后抑制了EMT過程，從而影響癌細胞的增殖和侵襲［15］。本研究結果顯示過表達lncRNA RUNX1-IT1后 E-cadherin顯著減少，而N-cadherin、β-catenin、Vimentin顯著增多；沉默lncRNA RUNX1-IT1后結果與之相反。PCNA是細胞增殖相關的蛋白。細胞周期從G1期向S期分化時，Cyclin D1的水平發(fā)生了改變。MMP2作為MMP家族的一員在細胞發(fā)生侵襲和遷移時發(fā)揮重要作用。PCNA、Cyclin D1和MMP2的表達水平均在lncRNA RUNX1-IT1過表達后顯著上調，在lncRNA RUNX1-IT1沉默后顯著下調。以上結果提示lncRNA RUNX1-IT1誘導CAL27細胞EMT的發(fā)生。

綜上所述，本研究首次發(fā)現lncRNA RUNX1-IT1在OSCC組織和CAL27、SCC25細胞中顯著高表達，lncRNA RUNX1-IT1高表達可以促進細胞增殖、加快細胞從G1期向S期分化，促進細胞遷移和EMT等惡性生物學行為，這為OSCC的研究提供了新的方向。