量子點流式微球技術用于DNA的檢測研究*

蔡冰潔，熊曉慶

（1.武漢大學人民醫院 檢驗科，湖北 武漢430060；2.海南醫學院 熱帶醫學與檢驗醫學院，海南 海口 571199）

目前基因檢測的方法主要有PCR、液態生物芯 片、基因芯片、微流控技術等，這些傳統的檢測方法有一些較明顯的缺陷，如操作繁瑣、易污染、耗時耗力、成本高等[1-4]。量子點是一種新型半導體納米材料，尺寸2 ～10 nm，是一種較傳統熒光染料更優良的熒光探針[5-7]。流式微球技術是在流式細胞術的基礎上新建的一種技術。其作用機制是通過攜帶有熒光信號的微球與待測物結合在一起形成一個可以發熒光的復合物，然后通過檢測其平均熒光強度反映待測物的濃度[8]。流式細胞儀可以對細胞水平之外的分子水平進行檢測[9-10]。為建立一種高通量、操作簡單、成本低的快速檢測方法，本文擬利用新型納米材料量子點流式微球技術檢測DNA，該新型方法結合量子點優異的熒光特性和流式微球技術的高通量，具有反應靈敏快速、操作簡單等優勢，利用微球-DNA-量子點夾心結構，通過檢測核酸雜交前后熒光強度的變化來實現DNA 的高通量快速檢測。該新型技術有望實現臨床疾病相關核酸分子的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

量子點購自武漢珈源量子點技術開發有限公司，鏈霉親和素包被的微球購自武漢珈源生物醫學工程有限公司，3-二甲基氨基丙基-N′-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基丁二酰亞胺（NHS）、生物素琥珀酰亞胺酯（生物素-NHS）購自美國Sigma Aldrich 公司，DNA 序列購自寶生生物工程（大連）有限公司（見表1），通過高效液相純化，并用1×磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋，其余試劑購自上海捷瑞生物有限公司。

1.2 儀器與設備

FACSCanto Ⅱ流式細胞儀（美國BD 醫療器械有限公司），干式恒溫器（杭州奧盛有限公司），HFsafe-1500TE 生物安全柜（上海力申有限公司），高速離心機（德國艾本德有限公司），震蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司），純水過濾器（法國ELGA 有限公司），YM75Z 高溫高壓滅菌鍋（上海三申醫療器械有限公司）。

表1 DNA 序列

1.3 方法

1.3.1 在微球表面固定探針P1（微球-P1）將25 μl、10 μmol/L 的探針P1 加入150 μl、5 mmol/L的生物素-NHS 中，室溫避光反應4 h，反應完后用1×PBS 洗滌3 次，除去未結合的探針，接著用1×PBS 配成50 μl、5 μmol/L 的生物素化的探針P1（Biotin-P1）。將約7 μg/ml 鏈霉親和素包被的微球用1×PBS 洗滌2 次后，取20 μl 洗滌后的磁珠溶液和5 μl、5 μmol/L Biotin-P1 于干燥的Ep 管中，混勻，室溫避光反應30 min。

1.3.2 量子點修飾探針P2（QDs-P2）將5 μl、10 mmol/L 的EDC，5 μl、10 mmol/L 的NHS，5 μl、2 μmol/L 的QDs，5 μl、400 μmol/L 的探針P2 分別加到干燥Ep 管中，室溫反應2 h，反應后用1×PBS洗滌3 次，最終用1×PBS 配成400 μl、5 μmol/L 的QDs-P2。

1.3.3 核酸雜交反應及檢測分析取1.3.1 中合成的微球-P1 與5 μl 不同濃度的DNA 在56℃恒溫箱中雜交30 min，接著于雜交體系中加入1.3.2 中QDs-P2在56℃恒溫箱中雜交30 min，雜交完成后用1×PBS將體系終體積補液至1 ml，隨后用流式細胞儀進行熒光信號檢測。分別研究互補DNA、單堿基錯配DNA及完全非互補DNA。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗，同時做一元線性(線性擬合)回歸分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗原理

灰色圓球為固定有探針DNA（探針P1）的磁珠，綠色為固定有探針DNA（探針P2）且發綠色熒光的量子點。首先，將靶DNA 與固定有能與DNA 一端互補的探針P1 的磁珠微球反應，然后加入能與DNA另一端互補雜交的QDs-P2，最后形成一個微球-P1-DNA-P2-QDs 復合結構，該結構為不易洗脫的復合物。用1×PBS 洗滌2 次，去除反應體系中未結合的物質，接著用流式細胞儀檢測其反應前后平均熒光強度的變化，該平均熒光強度與DNA 的濃度成正比，從而實現DNA 的檢測。見圖1。

2.2 方法可行性分析

為驗證該新型檢測方法的可行性，分別檢測空白組（不含DNA 和DNA 測試組的平均熒光強度變化。在沒有DNA 存在的條件下，微球-P1、QDs-P2 不能特異結合，洗滌后檢測其熒光信號，其熒光強度極弱，熒光強度僅在1 ～10 MFI；而在DNA 存在的條件下，微球-P1、DNA 及QDs-P2 核酸雜交，形成一個特異的緊密復合體結構，洗滌后檢測其熒光強度在10 ～100 MFI區間內較空白磁珠明顯增大。實驗結果符合預期，所以本實驗所設計方案具有可行性，可以用該新型方法檢測DNA。見圖2。

2.3 方法的敏感性

圖1 實驗原理圖

圖2 可行性驗證熒光圖

為檢驗方法的敏感性，分別將0.2、1.0、10.0、20.0 和100.0 nmol/L 互補DNA 加入體系中與微球-P1和QDs-P2 進行雜交，通過檢測雜交前后熒光強度的變化來分析方法的敏感性。流式細胞儀檢測到的平均熒光強度隨著DNA 濃度的升高，其熒光強度也不斷增強。因為DNA 的濃度越大，DNA 中的堿基對與探針DNA 互補序列中的堿基對雜交就愈多，從而形成的微球熒光復合結構越多，其熒光強度越大，所以隨著DNA 的濃度高，檢測到的熒光強度越強（見圖3）。熒光強度與DNA 濃度成良好的線性關系，其線性回歸方程為Y=23.55X+24.36[Y為平均熒光強度，X為lgC（DNA 濃度）]，方程的決定系數R2=0.989。基于3σ/S（σ 為空白對照的標準偏差，S 為線性方程的斜率），可計算該方法的最低檢測限為0.2 nmol/L。不同濃度DNA 測量值比較，差異有統計學意義（F=98.250，P=0.001）。DNA 濃度0.0 與0.2 nmol/L 的檢測值比較，差異有統計學意義（t=3.003，P=0.008），DNA 濃度0.2 與1.0 nmol/L 的檢測值比較，差異有統計學意義（t=5.232，P=0.001），DNA 濃度1.0 與10.0 nmol/L 的檢測值比較，差異有統計學意義（t=5.396，P=0.001），DNA 濃度10.0 與20.0 nmol/L 的檢測值比較，差異有統計學意義（t=6.663，P=0.001），DNA 濃度20.0 與100.0 nmol/L 的檢測值比較，差異有統計學意義（t=5.318，P=0.001）（見圖4）。

2.4 量子點流式微球技術的特異性

為探討本文構建的新檢測方法的特異性，分別將完全非互補DNA、單堿基錯配DNA、互補DNA 加入體系中反應。將100.0 nmol/L 完全非互補DNA、單堿基錯配DNA、互補DNA 分別與微球-P1 和QDs-P2 進行雜交反應，接著用流式細胞儀檢測雜交前后的熒光強度變化。不同DNA 在量子點流式微球技術中的熒光強度比較，差異有統計學意義（F=171.622，P=0.001）。完全非互補DNA 和單堿基錯配DNA 引起的熒光強度幾乎可以忽略不計，互補DNA 引起的熒光強度變化較完全非互補DNA 及單堿基錯配DNA 強。從實驗結果可知該新型方法可以很好地將互補DNA 和完全非互補DNA、單堿基錯配DNA 區別開來（P＜0.05），所以該技術對檢測DNA 具有很好的特異性。見圖5。

圖3 不同濃度DNA 在量子點流式微球技術中的平均熒光強度 （±s）

圖4 不同濃度DNA 在量子點流式微球技術中的線性擬合曲線

圖5 不同DNA 在量子點流式微球技術中的熒光強度（±s）

3 討論

量子點是一種可以應用到各種學科中的新型半導體納米材料，其粒子直徑往往＜20 nm，由幾種元素混合構成，其組成元素多是Ⅱ～Ⅳ族元素中的Zn S、Cd Se、Cd S 和Ⅲ～Ⅴ族元素中的In As、Pa 等[5，11-12]。傳統的熒光染料有一些明顯的缺陷，如熒光容易消散、激發光譜較窄、容易被光漂白、熒光效率低、對環境有危害等。量子點是一種新型熒光材料的出現，很好地解決傳統熒光染料的上述缺陷。量子點的性質比較活潑，熒光穩定且壽命長；激發光譜寬且發射光譜窄；通過調節量子點的組成元素和大小，改變熒光的發射光譜，實現不僅能檢測紫外區域，還可以檢測到紅外區域，減少因紫外輻射對生物體的危害；不會損壞檢測對象的結構，還可以接受激發光產生熒光；非常適用于生物分子的熒光標記[13-14]。綜上可知，量子點是一種非常優良的熒光探針，在未來的科學研究中有望被廣泛應用[15-18]。

近年來，一種可以定量檢測和分析細胞水平以及微生物水平的新方法流式細胞術產生[19]，流式細胞術可同時對多個參數進行分析，分析時間短且效率高，高通量且靈敏，還可以對其設定的檢測項目大量收集，并進行全面分析，具有非常強的靈活性，在臨床醫學中主要用于細胞分析[20]。流式微球技術是在流式細胞術的基礎上新建的一種技術，作用機制是通過攜帶有熒光信號的微球與待測物結合在一起形成一個可以發熒光的復合物，然后通過檢測其平均熒光強度從而反映待測物的濃度[21]。該技術檢測速度較快，可以通過將生物分子結合在微球上，從而實現在生物分子水平上的檢測，實現流式細胞儀對細胞水平之外的分子水平進行檢測[22-27]。

本實驗將高性能的量子點和流式細胞術結合，形成一種嶄新的量子點熒光探針流式微球技術用于DNA分子的快速、高通量檢測，該新型技術能高敏感性、高特異性地檢測DNA 分子，最低檢出限能達到0.2 nmol/L，且具有操作簡單、成本低、耗時短等優勢，有望用于各疾病相關核酸分子的高敏感性、高特異性及高通量的檢測。