槲皮素對支氣管哮喘小鼠氣道炎癥的作用及機制研究

朱翔，肖云斌，易曉蓮

（杭州師范大學附屬醫院 兒科，浙江 杭州 310015）

哮喘是一種慢性炎癥性肺病，其特征是氣道對過敏原的過度反應，氣道水腫和黏液分泌增加。目前中國約有兩千萬哮喘患者，其病死率位居世界前列[1]。支氣管哮喘是一種免疫介導的疾病，其特征為氣道高反應性和嗜酸性粒細胞性氣道炎癥，具體表現為慢性氣道炎癥、氣道黏液高分泌和氣道重塑[2]。其中T 輔助2 型細胞（T helper cell 2, Th2）在氣道中大量存在，其分泌的Th2 因子如白細胞介素-4（IL-4）和白細胞介素-5（IL-5）在哮喘的病理生理學中起關鍵作用[3]。

槲皮素是一種植物衍生的黃酮類化合物(化學命名為3，3'，4'，5，7-五羥基黃酮)，以其抗氧化和抗炎特性而廣為人知。大多數植物來源的次級代謝產物能夠直接影響炎癥介質關鍵的促炎分子表達[4]。黃酮類化合物是植物界常見的次生代謝產物。槲皮素存在于多種食物中，比如茶、洋蔥、蘋果和紅葡萄酒，具有抗氧化、抗炎、抗癌等多方面藥理作用，以及止咳、平喘和抗過敏等臨床作用[5-6]。有文獻報道，槲皮素對于哮喘有一定的療效，而且槲皮素能夠通過下調microRNA-155（miR-155）發揮抗炎作用[7]。本研究通過腹腔注射卵蛋白（Ovalbumin, OVA）致敏復制小鼠哮喘模型，研究槲皮素對IL-4 和IL-5 表達水平的影響，并探討其保護作用機制是否與下調miR-155 有關，以明確槲皮素治療哮喘的機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組與哮喘小鼠模型的復制

36 只10 周齡的BALB/c 雌性小鼠隨機分成6 組，即對照組（CON 組）、哮喘模型組（OVA 組）、槲皮素低劑量組（LOW 組)、槲皮素中劑量組（MID 組)、槲皮素高劑量組（HIGH 組）和地塞米松陽性對照組（POS 組），每組6 只。除CON 組外，分別在第1、7 和14 天分3 次對其他組小鼠進行致敏，每次每只小鼠腹腔注射200 μl OVA 混合液（含100 μg 卵清蛋白和4 mg 氫氧化鋁），CON 組腹腔注射等量的生理鹽水。除CON組外，在第21天對其他5組小鼠進行持續4 d的3%OVA 混合液霧化激發，CON 組則用等量生理鹽水霧化吸入。LOW 組、MID 組和HIGH 組小鼠在第18 天時分別用50、100 和200 mg/kg 槲皮素（美國Sigma 公司）溶液灌胃，POS 組用10 mg/kg 地塞米松（重慶市西南藥業股份有限公司）溶液灌胃，CON 組和OVA 組則用生理鹽水灌胃，連續1 周，1 次/d。

1.2 哮喘程度評分

通過觀察小鼠行為對哮喘的嚴重程度進行評估。表現正常為0 分；震顫或點頭為1 分；嗆咳為2 分；腹肌痙攣為3 分；跌倒為4 分[8]。

1.3 支氣管肺泡灌洗液標本采集

第28 天將小鼠處死，打開胸腔并結扎右肺門，分2 次每次用4 ml 生理鹽水灌洗左支氣管，反復抽吸灌洗液，總回抽支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid, BALF）約7 ml。收集灌洗液后于冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）中以5 000 r/min離心6 min，吸取上清液置入-80℃冰箱保存。

1.4 ELISA 法檢測IL-4 和IL-5 的含量

取BALF 標本，按照ELISA 試劑盒（武漢博士德生物科技公司）說明書步驟操作，樣品用酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）檢測其吸光度并計算樣品濃度。

1.5 qRT-PCR 檢測miR-155 基因表達水平

按照TaqMan microRNA Reverse Transcription Kit（美國Thermo Fisher Scientific 公司）的使用說明，在避光條件下分別配制miR 和U6 的反應體系。稱取適量肺組織，加入適量Trizol（美國Thermo Fisher Scientific 公司），冰上勻漿，提取總RNA。逆轉錄體系為5 μl RNA 模板、1 μl miR 逆轉錄探針、1 μl U6逆轉錄探針和8 μl DEPC 水，混勻離心后于PCR 儀反應，反應條件： 96℃變性20 min， 42℃退火30 min，85℃延伸5 min，經逆轉錄制成cDNA。使用實時PCR儀（美國Applied Biosystems 公司）進行qRT-PCR 反應，反應條件為95℃預變性10 min，95℃變性10 s，60℃延伸45 s，重復40 個循環。以U6 作為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算各組小鼠肺組織miR-155 的表達水平。

1.6 統計學方法

數據分析采用SPSS 21.0 統計軟件,計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用One-way ANOVA結合SNK-q檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 槲皮素對小鼠的支氣管哮喘的影響

各組哮喘癥狀評分比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。與CON 組比較，OVA 組小鼠的哮喘評分上升，小鼠出現嗆咳、腹肌抽搐和運動功能失調，這表明OVA 誘導支氣管哮喘小鼠模型復制成功。而用槲皮素對哮喘小鼠給藥后，隨著槲皮素濃度的增加，小鼠哮喘評分降低，哮喘癥狀減輕。見表1。

2.2 槲皮素對炎癥因子的影響

各組IL-4 和IL-5 水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。OVA 組小鼠BALF的上清液中IL-4和IL-5水平高于CON 組，而在槲皮素不同濃度組，IL-4和IL-5 水平均低于OVA 組（P＜0.05），且槲皮素濃度越高，IL-4 和IL-5 水平越低。見表2。

2.3 槲皮素對miR-155 相對表達量的影響

各組miR-155 相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。與CON 組比較，OVA 組中miR-155上調（P＜0.05）。而在槲皮素不同濃度組，miR-155的相對表達量均低于OVA 組（P＜0.05），且槲皮素濃度越高，miR-155 的相對表達量越低。見表3。

表1 各組小鼠哮喘癥狀評分 （±s）

表1 各組小鼠哮喘癥狀評分 （±s）

注： ①與CON 組比較，P ＜0.05；②與OVA 組比較，P ＜0.05；③與LOW 組比較，P ＜0.05；④與MID 組比較，P ＜0.05。

組別 n 哮喘癥狀評分CON 組 6 0.00±0.00 OVA 組 6 3.38±1.06①LOW+MID+HIGH 組 18 1.75±0.99②LOW 組 6 2.25±0.46②MID 組 6 1.88±1.13②③HIGH 組 6 1.13±0.99②③④POS 組 6 0.88±0.64②F 值 16.700 P 值 0.000

表2 各組小鼠BALF 的上清液炎癥因子水平 （±s）

表2 各組小鼠BALF 的上清液炎癥因子水平 （±s）

注： ①與CON 組比較，P ＜0.05；②與OVA 組比較，P ＜0.05；③與LOW 組比較，P ＜0.05；④與MID 組比較，P ＜0.05。

組別 n IL-4 IL-5 CON 組 6 21.97±4.34 25.77±4.65 OVA 組 6 172.28±21.65① 213.70±14.54①LOW+MID+HIGH 組 18 79.47±26.06② 87.74±29.86②LOW 組 6 117.89±12.15② 130.19±18.57②MID 組 6 77.07±3.52②③ 81.73±8.40②③HIGH 組 6 43.36±6.27②③④ 50.53±9.21②③④POS 組 6 27.53±2.42② 38.57±11.16②F 值 88.242 109.336 P 值 0.000 0.000

表3 各組小鼠肺組織miR-155 相對表達量 （±s）

表3 各組小鼠肺組織miR-155 相對表達量 （±s）

注： ①與CON 組比較，P ＜0.05；②與OVA 組比較，P ＜0.05；③與LOW 組比較，P ＜0.05；④與MID 組比較，P ＜0.05

組別 n miR-155 CON 組 6 100.00±13.61 OVA 組 6 357.37±11.26①LOW+MID+HIGH 組 18 213.51±56.15②LOW 組 6 289.13±21.31②MID 組 6 206.55±32.09②③HIGH 組 6 143.41±16.46②③④POS 組 6 122.87±15.31②F 值 75.141 P 值 0.000

3 討論

過敏性哮喘是一種復雜的炎癥性疾病，其特征是氣道高反應性，嗜酸性粒細胞炎癥和杯狀細胞黏液分泌過多，伴有肺內細胞產生的IL-4 和IL-5 等炎癥介質，從而導致氣道炎癥反應的發生[9]。IL-4 與其他炎癥因子整合信號傳導，通過刺激嗜酸性粒細胞特異性黏附途徑并調節肺嗜酸性粒細胞增多。IL-5 不僅可以活化嗜酸性粒細胞，并參與嗜酸性粒細胞前體終末分化和增殖。此外，嗜酸性粒細胞從骨髓遷移到血液這一過程也依賴于IL-5[4]。miR-155 是一種重要的miRNAs，其可調節自身免疫和炎癥反應。有研究顯示，miR-155 在過敏性哮喘中上調，表明其在過敏性哮喘中發揮重要作用。miR-155 缺失抑制Th2 啟動能力，從而緩解小鼠過敏性氣道炎癥[10]。

黃酮類化合物槲皮素具有抗炎和抗過敏的特性。在豚鼠哮喘模型中，槲皮素可預防過敏原與血小板活化因子所誘導的支氣管阻塞和支氣管高反應性[11]。前期研究表明，槲皮素對哮喘小鼠具有一定的保護作用，但其在哮喘發病機制方面的研究甚少。

本研究通過復制OVA 誘發的小鼠哮喘模型，一方面證明槲皮素對氣道炎癥有抑制作用，對哮喘反應具有緩解作用；另一方面明確槲皮素保護支氣管哮喘小鼠的作用與下調IL-4、IL-5 和miR-155 有關。這些發現為槲皮素在哮喘小鼠模型中的作用提供了新的見解，并且拓寬目前對槲皮素免疫藥理學功能的認識和理解，為槲皮素防治支氣管哮喘提供參考證據。