P62基因對惡性黑色素瘤細胞侵襲的影響及機制研究

易娟娟，招玉玲，謝蒲輝，唐妍，黃惠珍，鄭麗，蔡艷桃，楊競，張晶，毛越蘋

（1.佛山市婦幼保健院 皮膚科，廣東 佛山 528000；2.中山大學孫逸仙紀念醫院 皮膚科，廣東 廣州 510120）

惡性黑色素瘤發病率較低，但病死率非常高，主要是由于細胞生物惡性程度高，且極易侵襲、轉移。因而探索惡性黑色素瘤的侵襲、轉移機制顯得尤為重要，有助于為臨床靶點治療提供新的理論依據。

P62是一個經典的自噬標志基因，其在調控細胞生長、凋亡等生理過程中發揮重要作用[1]。胰腺癌中，P62 與核轉錄因子NRF2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2, NRF2）的激活可以誘導腫瘤細胞化療耐受[2]。卵巢癌中，P62 的聚集可以激活含半胱氨酸的天冬氨酸特異水解酶（cystine containing asparate specific protease-8, Caspase-8），從而促進卵巢癌的進展[3]。食管癌中，P62 蛋白受microRNA-487a 的靶擊，從而促進食管癌細胞的增殖[4]。此外，P62 在乳腺癌中可以通過穩定癌基因MYC的信使RNA 從而維持腫瘤的干性特征，且P62 通過與波形蛋白Vimentin 相互作用促進乳腺癌轉移[5-6]。另有報道，Ⅲ型磷脂酰肌醇激酶VPS34 通過刺激P62 磷酸化參與乳腺癌的發生、發展[7]。上述報道表明，P62 在多種腫瘤的發生發展、生理功能中發揮著重要的作用。盡管如此，P62 在惡性黑色素瘤中的生理作用及機制尚未見報道。本課題組前期研究發現，P62 可以發揮促進黑色素瘤細胞增殖及誘導細胞周期轉化的作用，P62 也參與黑色素瘤侵襲、轉移的過程[8]。因此，本實驗探討P62 在黑色素瘤細胞遷移、侵襲中的作用及其具體機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人惡性黑色素瘤細胞株A375 細胞（購自上海生命科學研究院細胞資源中心，本實驗室永久保存），DMEM 培養基（美國Hyclone 公司），胎牛血清（澳大利亞Gibco 公司），0.25%胰蛋白酶（澳大利亞Gibco 公司），Transwell 小室（美國Corning公司），結晶紫染色液（上海碧云天生物技術有限公司），二甲苯和中性樹膠（廣州鑫邦有限公司），OPTI-MEMI 培養液（澳大利亞Gibco 公司），日本尼康Ti-S 顯微鏡，干擾P62表達的siRNA（其序列為GCACAAAUUUGGUAAGUCA）及陰性對照siRNA（廣州銳博有限公司）。Western blotting 抗體如下： 兔抗β-catenin、兔抗c-Jun，鼠抗ZEB1，兔抗Axin、兔抗TCF4、兔抗c-Myc、兔抗P62、兔抗GAPDH、兔抗CCND1、兔二抗、鼠二抗均購自美國Proteintech 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養人惡性黑色素瘤A375 細胞在含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養基，37℃、5%二氧化碳CO2條件下傳代培養。取處于70%對數生長期的細胞用于實驗。

1.2.2 siRNA 轉染轉染前1 d，分別將細胞按1.0×105個/孔接種于6 孔板中，加入2 ml 含血清的高糖DMEM 培養基，37℃、5% CO2條件下培養至≥55%融合。將干擾P62基因表達的siRNA 和陰性對照siRNA 轉染A375 細胞，分別作為干擾組和對照組。①分別取10μl/孔siRNA 溶液與無血清OPTI-MEMI培養基250μl/孔在2 ml EP 管中輕輕混勻（干擾組與對照組均設3 個復孔，干擾組： siRNA-P62 溶液30μl+無血清OPTI-MEMI 培養基750μl；對照組： 陰性對照溶液30μl+無血清OPTI-MEMI 培養基750μl）。分別取陽離子脂質體Lipofectamine 2000 轉染試劑5μl/孔，與無血清OPTI-MEMI 培養基250μl/孔在另一個2 ml EP 管中輕輕混勻（干擾組與對照組均設3 個復孔，干擾組： Lipofectamine 2000 轉染試劑15μl+無血清OPTI-MEMI 培養基750μl；對照組： Lipofectamine 2000 轉染試劑15μl+無血清OPTIMEMI 培養基750μl），兩組分別置于室溫下孵育5 min。②將上述孵育后的siRNA 混合液分別與孵育后的Lipofectamine 2000 混合液（即上述Lipofectamine 2000 轉染試劑+無血清OPTI-MEMI 培養基）輕輕混合，室溫條件下孵育20 min 以形成轉染混合物。③吸棄原6 孔板中的培養基，用PBS 洗2 遍，分別在每個孔中加入1.5 ml 新鮮含血清的高糖DMEM 培養基，將上述孵育后的混合液分別加入新DMEM 培養基的6孔板中。每組3個復孔。④將6孔板置于孵箱37℃、5%CO2條件下培養，6 h 后棄舊培養基，用無菌PBS 洗2 遍，換2 ml 含10%血清的DMEM 培養基。24 h 后行Transwell 實驗，48 h 后行Western blotting 檢測。

1.2.3 Transwell 實驗轉染24 h 后取6 孔板干擾組和對照組細胞（選取生長狀態良好的轉染后黑色素瘤A375 細胞）。0.25%胰酶消化細胞，終止消化后離心，用無血清培養基調整細胞密度至1×106個/ml（即每100μl 含1×105個細胞）。在配套的24 孔板加入500μl 含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養基，將Transwell 小室放進24 孔中，確保沒有氣泡（每組設3 個復孔）。取無血清細胞懸液l00μl 加入Transwell小室的上室中，常規培養12 h（觀察5 ～10 個細胞穿膜），終止培養。取出上室，將未穿膜的上室內細胞用濕棉簽擦去，甲醇固定細胞30 min。移到500μl結晶紫染液的孔中染色15 min。蒸餾水沖洗，將小室風干，剪下小室膜，晾干，二甲苯和中性樹膠（比例1 ∶1）封片。干燥后于正顯微鏡下隨機選擇5 個高倍視野拍照，計算穿過Transwell 小室膜的平均細胞數。

1.2.4 Western blotting取處于對數生長期轉染后48 h 的干擾組及對照組細胞，用PBS 溶液洗滌細胞3 次，在冰上加入放射免疫沉淀測定裂解液+蛋白酶抑制劑+磷酸酶抑制劑（比例100 ∶1 ∶1）裂解細胞，孵育30 min，使細胞完全裂解、離心。留取適量上清測蛋白濃度，以蛋白含量為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。取相同濃度的樣品加入Loading buffer金屬浴變性。配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠。在電泳槽中加入變性后的樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（80 V，30 min；100 V，120 min），之后電轉移（350 mA，3 h）把目的蛋白從凝膠中轉移到硝酸纖維素膜上，洗膜，孵育一抗（濃度1 ∶1 000）過夜。第2 天，洗膜，孵育鼠二抗或兔二抗（濃度1 ∶5 000），加入顯色ECL 增強型化學發光酶反應底物，在化學發光儀上顯示目的蛋白條帶。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 21.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 P62 對黑色素瘤細胞穿膜的影響

兩組Transwell 實驗結果見圖1。干擾組的穿膜細胞數為（54.33±4.16）×109個；對照組穿膜細胞數為（126.70±4.04）×109個（見圖2）。兩組穿膜細胞數比較，經t檢驗，差異有統計學意義（t=21.620，P=0.000），干擾組穿膜細胞數低于對照組。

2.2 P62 對黑色素瘤A375 細胞Wnt/β-catenin及下游通路的影響

兩組P62、ZEB1、β-catenin、TCF4、c-Myc、c-Jun及CCND1 蛋白相對表達量比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），干擾組低于對照組。見表1和圖3。

圖1 兩組Transwell 實驗結果 （×200）

圖2 兩組Transwell 穿膜細胞數比較 （±s）

表1 兩組Wnt/β-catenin 及下游通路的蛋白相對表達量比較 （±s）

表1 兩組Wnt/β-catenin 及下游通路的蛋白相對表達量比較 （±s）

組別 P62 ZEB1 β-catenin TCF4 c-Myc c-Jun CCND1干擾組 0.085±0.008 0.422±0.072 0.265±0.091 0.119±0.004 0.128±0.053 0.271±0.095 0.101±0.078對照組 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 t 值 198.103 13.905 13.990 381.484 28.497 13.291 19.963 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

圖3 P62 對Wnt/β-catenin 及下游通路的影響

3 討論

惡性黑色素瘤就診時往往已處于晚期，其生物惡性程度高，易侵襲、轉移，病情進展迅速，預后極差。關于惡性黑色素瘤的發生、發展機制報道較多，但仍不足以闡明其具體的發病進展過程。因此，探討黑色素瘤的發病機制意義重大，有助于臨床開發靶向治療藥物，改善黑色素瘤患者的總體預后。

P62 是一種經典的自噬標志物，參與多種細胞信號傳導調控及自噬過程[1]，在細胞生長、凋亡等過程中發揮重要的生理功能。Wnt/β-catenin 通路在動物胚胎的早期發育、器官形成、組織再生及其他生理過程中具有至關重要的作用；同時與腫瘤細胞的侵襲、轉移密切相關。如果這條信號通路被異常激活，就可能誘導癌癥的發生、發展。P62 與Wnt/β-catenin相關通路在神經膠質瘤[9]、肝癌[10]、舌鱗癌[11]及卵巢癌[12]中的作用已有報道，然而在黑色素瘤中報道較少。

本課題組前期研究發現，P62可以促進惡性黑色素瘤細胞增殖及周期轉化，表明P62在黑色素瘤中發揮癌基因的作用[8]。本研究結果顯示，干擾P62 表達后黑色素瘤細胞的遷移、侵襲數目減少，與前期報道[9-12]一致，進一步支持P62 在黑色素瘤中發揮促癌因子的作用。

本研究進一步探討P62 在黑色素瘤侵襲、轉移過程中的具體機制。Western blotting 檢測結果證實，干擾P62 表達后的Wnt/β-catenin 經典通路及下游相關因子（P62、β-catenin、TCF4、ZEB1、c-Myc、c-Jun 及CCND1）的表達均受抑制。TCF4 核轉錄因子是Wnt/β-catenin 經典通路的關鍵下游因子。當Wnt/β-catenin 通路被異常激活后，GSK3β/Axin/APC復合體降解β-catenin 受阻，導致胞漿內β-catenin大量蓄積，引起β-catenin 穿核與TCF4 結合，誘導下游因子ZEB1、c-Myc、c-Jun 及CCND1 等的大量表達，進而促進腫瘤細胞侵襲、轉移。因而本研究提示P62在促進黑色素瘤侵襲、轉移過程中發揮重要作用，其可能通過激活Wnt/β-catenin 相關通路及下游因子的表達促進細胞侵襲、轉移。下一步的研究需要繼續探索P62 調控Wnt/β-catenin 通路及下游相關因子表達的具體機制。

綜上所述，P62 可能通過調控Wnt/β-catenin 相關通路及下游因子發揮促進黑色素瘤細胞侵襲、轉移的作用。將來需要進一步研究P62 調控Wnt/β-catenin相關通路的具體機制。