先天性心臟病患兒術后發生急性腎損傷的危險因素及早期檢測血清microRNA-203的意義

熊田辛，查正彪，鄭智，郭倩男，陳亮，潘友民

（華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院 心臟大血管外科， 湖北 武漢 430030）

先天性心臟病（以下簡稱先心病）在我國圍產兒中的發病率較高，占8‰～10‰[1]。近些年隨著心外科手術的日臻成熟，先心病患兒手術成功率也隨之提高，但是術后并發癥仍然是影響患兒預后最主要的原因，尤其是術后急性腎損傷（acute kidney injury, AKI）的發生率甚至高達20%以上；且一旦術后發生嚴重的AKI，迄今為止臨床尚缺乏理想的針對性治療[2]。因此，術后AKI 發生前早預測、合理干預仍然是目前臨床改善先心病患兒手術預后、降低病死率的關鍵。MicroRNA（miRNA）屬于一類內源性短鏈RNA，具有組織特異性、結構保守性等特點，在AKI 發病中扮演著重要角色。

腎損傷分子-1（kidney injury molecule-1, KIM-1）是目前研究較為成熟的用于診斷AKI的特異性指標[3]，在受損的腎臟組織中高表達，但是無法對AKI 的發生發揮預警作用，而且易受年齡、性別及免疫狀態等多種外源性因素的影響。有學者通過細胞實驗證實，KIM-1 和miR-203 具有一定的調控作用[4]。本研究對采用改良兒童腎臟疾病風險分級（pediatric risk injury failure loss and end stage renal disease, pRIFLE）。分析接受先心病手術發生AKI 的患兒的臨床資料，以探討AKI 發生的危險因素，以及術后血清miR-235 對AKI的臨床預警價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年9月—2018年1月在華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院住院的178 例先心病患兒。其中，男性107 例，女性71 例；年齡2 個月～6 歲，平均（4.37±1.42）歲。所有患兒入院后接受先心病體外循環體外直視手術。納入標準： ①年齡≤6 歲；②術前根據心電圖、超聲心動圖、胸片、常規檢查及生物化學檢查確診為先心病，其中57 例患兒為單純房間隔缺損（atrial septal defect, ASD），53 例患兒為單純室間隔缺損（ventricular septal defect, VSD），39 例患兒為ASD 合并VSD，29 例患兒為動脈導管未閉（patent ductus arteriosus, PDA）；③術前腎功能正常。排除標準： ①先天性腎功能不全；②住院后造影劑、藥物等可能致腎損傷；③心臟衰竭或呼吸衰竭；④48 h 內死亡或資料不全；⑤急診手術。本研究所有過程遵從赫爾辛基宣言標準，本研究通過醫院倫理委員會批準，患兒家屬或法定監護人簽署知情同意書。

1.2 方法

根據pRIFLE 推薦的AKI 診斷標準[5]： 術后48 h內肌酐清除率（creatinine clearance, CC）較術前降低25%，或尿量＜0.5 ml/（kg·h）≥8 h，將患兒分為AKI 組53 例和非AKI 組125 例。

1.3 主要儀器及試劑

1.3.1 主要儀器Primus 麻醉機（美國Drager 公司），Jostra HL20心肺機（德國Maquel公司），iE33超聲儀（荷蘭Philips 公司），肝素鈉真空采血管（美國BD 公司）。

1.3.2 主要試劑硫酸阿托品注射液（天津金耀藥業有限公司，批號： 20160833），丙泊酚（德國Fresenius kabi 公司，批號： 10GF3917），咪達唑侖（瑞士Roche公司，批號： B1297），雷尼芬太尼（宜昌人福藥業有限責任公司，批號： 6150314），維庫溴銨（浙江仙居制藥股份有限公司，批號： 150116），七氟醚（美國雅培制藥公司，批號： 7928），酶聯免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司），Taqman? MicroRNA Reverse Transcription Kit 和Taqman? MicroRNA Assay Kit 試 劑盒（日本TaKaRa 公司）。

1.4 方法

1.4.1 手術方法所有入組患兒采用心臟外科統一標準的麻醉、手術、體外循環和術后監護。術前30 min 肌內注射硫酸阿托品注射液0.1 mg/kg，靜脈推注丙泊酚1 mg/kg，待患兒入睡后進入手術室。進入手術室后，開放外周靜脈，咪達唑侖0.1 mg/kg、雷尼芬太尼1.0 ～1.5μg/kg 及肌松藥維庫溴銨0.6 mg/kg 誘導后插管麻醉，咪達唑侖、雷尼芬太尼、維庫溴銨及七氟醚吸入維持麻醉，連接Primus 麻醉機行機械通氣。正中開胸，體外循環下修補心臟畸形，連接Jostra HL20 心肺機行體外循環。采用iE33 超聲儀確定心臟畸形糾正后開始復溫，有需要時超濾至血紅蛋白（Hb）＞10 g/dl，使用正性肌力藥物。血流動力學穩定后中和肝素，關胸后送至兒童重癥監護病房。

1.4.2 一般臨床資料收集檢測所有患兒手術前后腎功能水平、尿量，記錄年齡、性別、體重、臨床診斷、先天性心臟病手術風險評估共識（the risk adjustment for congenital heart sugery-1, RACHS-1）評分等。記錄術中體外循環時間、阻斷升主動脈時間、是否多次阻斷升主動脈、心肌保護方式[間斷性灌注4 ∶1 含血高鉀停跳液（以下簡稱血灌）或全晶體液（Custodial液，以下簡稱晶灌）]、是否超濾、是否深低溫停循環或低流量灌注（低于目標灌注流量的一半以上），以及圍手術期血制品用量（包括體外循環預沖及術中、術后）等。

1.4.3 血液標本采集患兒麻醉誘導前和拔管后2、12、24 及48 h 時采集外周靜脈血3 ml 置于肝素鈉真空采血管（美國BD 公司）中，取上清、分裝，-80℃保存備用。

1.4.4 檢測指標取血液標本檢測Hb、尿素氮（BUN）、血清肌酐（Scr）、血糖及乳酸。ELISA 檢測血液KIM-1 水平，試劑盒由上海酶聯生物科技有限公司提供，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR） 檢測血清miR-203提取總RNA，根據Taqman?MicroRNA Reverse Transcription Kit 和Taqman?MicroRNA Assay Kit 試劑盒說明書操作，進行逆轉錄反應。將cDNA 置于-20℃保存備用。按照三步法進行PCR 擴增。以cDNA 為模板，以小分子U6 作為內參，冰浴中配制20μl。PCR 反應條件： 95℃預變性0 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，共40 個循環，60℃繼續循環5 min。根據NCBI 數據庫獲得的資料設計引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。miR-203 正向引物： 5'-GCGCTGGTAGACTATGGAA-3'；反向引物： 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'，長度97 bp。PCR 結果判斷： 根據使用說明調整基線，將閾值設定在熒光值對數圖的線性部分，從軟件中讀取Ct 值。ΔCt=Ct 樣品-Ct 內參，ΔΔCt=ΔCt-（Ct 隨機陰性對照樣品-Ct內參），以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA 相對表達量。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0 統計軟件。計量資料以（±s）表示，比較用獨立樣本t檢驗或用重復測量設計的方差分析；計數資料以（%）表示，比較用χ2檢驗；采用受試者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲線確定目標指標的診斷價值，采用二分類變量Logistic 回歸模型分析先心病患兒術后發生AKI 的危險因素，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 先心病患兒術后AKI 發生情況

根據pRIFLE推薦的AKI診斷標準，53 例（29.78%）患兒術后發生AKI，125 例（70.22%）患兒未發生AKI。其中，45 例（84.91%）患兒術后24 h 內發生AKI，8 例（15.09%）患兒術后24 ～48 h 內發生AKI。

2.2 兩組患兒術前和術中臨床資料比較

兩組患兒年齡、術前紫紺型先心病比例、體外循環時間、阻斷升主動脈時間、采用血灌進行心肌保護的比例及深低溫停循環或低流量比較，經獨立樣本t檢驗或χ2檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），AKI 組年齡和采用血灌進行心肌保護的比例低于非AKI 組患兒，而術前紫紺型先心病、深低溫停循環或低流量高于非AKI 組，體外循環時間、阻斷升主動脈時間長于非AKI 組。見表1。

表1 兩組患兒術前和術中臨床資料比較

2.3 兩組術前和術后不同時間點的KIM-1、miR-203 水平比較

兩組術前，以及術后2、12、24 和48 h 的KIM-1、miR-203 水平比較，采用重復測量設計的方差分析，結果： ①不同時間點的KIM-1、miR-203 水平有差異（F=31.864 和39.168，均P=0.000）；②兩組 的KIM-1、miR-203水平有差異（F=49.443 和118.218，均P=0.000）；③兩組的KIM-1、miR-203水平變化趨勢有差異（F=11.153 和24.857，均P=0.00）。AKI 組患兒循環血中KIM-1 水平在術后24 h時達峰值，而miR-203 水平在12 h 時已達峰值。見表2、3。

表2 兩組術前和術后不同時間點的KIM-1 水平變化 （±s）

表2 兩組術前和術后不同時間點的KIM-1 水平變化 （±s）

組別 n 術前 術后2 h 術后12 h 術后24 h 術后48 h非AKI 組 125 264.75±78.36 268.93±85.17 269.77±86.43 261.36±90.79 254.63±88.31 AKI 組 53 283.01±92.85 300.13±124.98 350.25±81.29 626.36±147.86 581.43±110.71

表3 兩組術前和術后不同時間點的miR-203 水平變化 （pg/ml，±s）

表3 兩組術前和術后不同時間點的miR-203 水平變化 （pg/ml，±s）

組別 n 術前 術后2 h 術后12 h 術后24 h 術后48 h非AKI 組 125 1.27±0.36 1.28±0.42 1.23±0.48 1.20±0.35 1.25±0.41 AKI 組 53 1.34±0.53 1.82±0.38 2.34±0.39 2.15±0.52 1.97±0.43

2.4 術后2 h 血清miR-203 對先心病患兒發生AKI 的預測能力

ROC 曲線分析顯示，術后2 h 血清miR-203 截斷值為1.700，其曲線下的面積為0.851（95% CI： 0.775，0.928），敏感性為85.42%（95% CI： 0.825，0.874），特異性為54.17%（95% CI： 0.537，0.587）。見圖1。

2.5 AKI 發生的危險因素

以發生AKI 作為因變量（AKI 賦值為1，非AKI賦值為0），將上述差異有統計學意義的變量，包括年齡、體外循環時間、阻斷升主動脈時間、術后2 h 血清miR-203 和、KIM-1 表達水平取中位值；以是否為紫紺型先心病、是否采取血灌方式，分別進行賦值作為自變量，采用二分類變量Logistic 回歸模型分析先心病患兒術后發生AKI 的危險因素。引入水準為0.05，剔除水準為0.10。結果顯示，年齡＜4 歲、紫紺型先心病、體外循環時間＞175.68 min、阻斷升主動脈時間＞101.45 min 及術后2 h 血清miR-203＞1.70 是發生AKI 的獨立危險因素（P＜0.05）；而血灌心肌保護是發生AKI 的獨立保護因素（P＜0.05）。見表4。

圖1 先心病患兒術后2 h 血清miR-203 預測AKI 的ROC 曲線

表4 先心病患兒術后發生AKI 的多因素Logistic 回歸分析參數

3 討論

AKI 是先心病患兒術后預后不良甚至死亡的最主要原因之一，發生率為12.5%～71.0%[6]。本研究中共納入178 例先心病患兒作為受試對象，接受體外循環術后48 h 內有53 例患兒出現AKI 指征，AKI 的發生率為29.78%，這與國內的流行病學資料基本一致。體外循環屬于非生理性循環狀態，在整個手術過程中，機體血流動力學改變、非搏動性灌注、腎灌注壓降低、心內吸引、持續灌注、易造成紅細胞損傷和全身炎癥反應等都可導致術后AKI 的發生[7]。TODA 等[8]發現，先心病患兒術后發生AKI 的臨床特點和危險因素與成人不同，年齡越小，先心病患兒術后發生AKI 的風險越高，這可能是因為患兒年齡越小，機體免疫功能和腎功能尚未發育完全，腎小管上皮細胞等還在繼續分化成熟。剛出生的新生兒腎小球濾過率僅為成年人群的50%，1 歲后才能達90%，說明患兒年齡越小，基礎腎功能越差。所以納入的患兒年齡＜6 歲，研究這一高風險年齡段患兒體外循環術后發生AKI 的風險因素更具有臨床價值。

本研究中，年齡＜4 歲、紫紺型先心病、體外循環時間＞175.68 min、阻斷升主動脈時間＞101.45 min及術后2 h 血清miR-203＞1.70 是發生AKI 的獨立危險因素，而血灌心肌保護是發生AKI 的獨立保護因素。首先年齡越小，患兒腎功能尚不成熟，可能會影響藥物的吸收、分布、代謝和排泄過程，提高腎臟對手術和麻醉制劑的敏感性[9]。除此以外，由于先心病患兒長期慢性缺氧和充血性心力衰竭，出現紫紺的患兒基礎腎功能相對較差；而在手術過程中，體外循環和阻斷升主動脈時間越長，先心病患兒術后出現AKI 的風險更高。胡秀紅等[3]曾提出先心病患者體外循環術前Scr 水平升高是影響AKI 發生的獨立危險因素。但是本研究并未發現兩組患兒術前Scr 水平有差異，相反兩組患兒術前Scr 水平基本一致，這可能和兒童與成人的腎功能差異有關。Scr 屬于內生性肌酐，是肌肉中的磷酸肌酸通過不可逆的非酶脫水反應轉化而成，通過腎臟排出[9-10]。如果內生肌酐的量相等，Scr 越低則CC 越高，理論上基礎腎功能越好[11]。但是內生肌酐量與肌肉含量和質量密切相關，圍產兒機體肌肉含量逐漸升高，并不像成人一樣維持在較為恒定的范圍內，因此不能單純依靠Scr 水平診斷嬰幼兒AKI 的發生。

在前期調研和預實驗過程中，筆者發現miR-203是KIM-1 的上游靶基因。本研究也證實，術后2 h 血清miR-203 水平是影響先心病患兒發生AKI 的獨立危險因素。KIM-1 是一種敏感性較高的腎功能損傷指標，但是易受年齡、性別、基礎疾病及蛋白攝入等多種因素的干擾，最佳診斷效能的時間窗出現在術后12 ～24 h[12]，具有一定的滯后性且敏感性較低，易造成漏診或誤診。除Scr 外，尿量也屬于早期診斷先心病患兒發生AKI 的重要指標，但是嬰幼兒的尿液采集較為困難，不適宜作為先心病患兒早期診斷AKI 發生的指標之一[13]。

miRNAs 是真核生物基因中一類非編碼的負性調控RNA，可以通過與靶基因3'-非編碼區結合抑制RNA 轉錄[14]，但是miRNAs 在兒科領域的研究尚處于空白階段。通過XIAO 等[4]的研究發現，KIM-1 與miR-203 的表達量具有一定的調控關系。在腎損傷小鼠模型腎組織中，miR-203 水平降低，并且與基因高甲基化狀態有關。但是本研究發現，小兒心臟手術后短期內血清miR-203 呈升高趨勢，且在AKI 確診前，血清miR-203 表達變化較Scr、尿量出現得更早，并且miR-203 水平升高是先心病患兒發生AKI 的獨立危險因素，提示可以在早期預測先心病患兒發生AKI的風險。體外循環導致患兒AKI 的原因十分復雜，但是均與急性期炎癥反應有關，包括補體活化、細胞因子釋放及樹突狀細胞活化等，例如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）具有直接細胞毒作用，同時降低腎小球血流量和濾過率，刺激炎癥細胞浸潤。白細胞介素-6（Interleukin-6, IL-6）也是導致腎小管損傷的重要因素。而近期LI 等[15]和WANG 等[16]都發現，上調miR-203 水平可誘導內皮細胞炎癥反應，同時促進TNF-α 和IL-6 的表達。除此以外，miR-203 能夠加速腎小管上皮細胞凋亡，加重腎小管損傷。因此在本研究中，AKI 組患兒術后血清miR-203 水平迅速升高可能與急性期炎癥反應密切相關[17]。

綜上所述，年齡＜4 歲、紫紺型先心病、體外循環時間＞175.68 min、阻斷升主動脈時間＞101.45 min及術后2 h 血清miR-203＞1.70 是先心病患兒體外循環術后發生AKI 的獨立危險因素，而血灌心肌保護是發生AKI 的獨立保護因素。圍手術期應重視對危險因素的干預，以降低先心病患兒體外循環術后發生AKI的風險。除此以外，血清miR-203 有望成為先心病患兒發生AKI 的早期預警分子，但是仍需大樣本研究進一步證實。