脫嘌呤脫嘧啶核酸內切酶1在結直腸癌組織中的表達及臨床意義

翁壽向，楊佩濃

（浙江省臺州醫院 病理科，浙江 臨海 317000）

結直腸癌為最常見的消化系統惡性腫瘤之一，發病率和病死率較高，近年來發病率呈遞增趨勢。大部分結直腸癌患者初診時已為中晚期，預后較差。結直腸癌的治療雖然已取得較大進步，但是治愈率和生存率提高不明顯，仍存在轉移風險高、缺乏有效的治療靶點等問題。因此，尋找結直腸癌新的基因作為治療靶點具有重要意義。脫嘌呤脫嘧啶核酸內切酶1（apurinic/apyrimidinic endonuclease 1, APE1）被證實在多種惡性腫瘤中表達[1]，為脫嘌呤/嘧啶內切酶的主要活性成分，其高表達和多種惡性腫瘤的發生發展以及預后關系密切[2-3]。本文對結直腸癌組織中APE1 表達及其與臨床病理特點和預后的關系進行研究，探討其在結直腸癌中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年10月—2017年9月浙江省臺州醫院收治的100 例結直腸癌患者的結直腸癌組織及其癌旁組織（距離腫瘤切緣≥5 cm）標本，組織標本采集后立即放入液氮中保存。其中，男性56 例，女性44 例；年齡（62.75±8.43）歲；結腸癌46 例，直腸癌54 例；腫瘤直徑（4.72±2.37）cm；腫瘤分期： Ⅰ期37 例，Ⅱ期26 例，Ⅲ期28 例，Ⅳ期9 例；分化程度： 低分化35例，中分化38例，高分化27例；淋巴結轉移25例；遠處轉移18 例。納入標準： ①臨床資料完整；②病理證實為結直腸癌；③足夠樣本量行免疫組織化學染色；④接受隨訪。排除標準： ①結直腸癌復發；②其他部位惡性腫瘤；③既往接受放化療等其他治療。本研究通過醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器鼠抗人APE1 單克隆抗體、二抗及DAB 顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，艾博抗購自上海貿易有限公司，廣東美的公司WK2102 電磁爐，APE1 購自英國Abcam 公司。

1.2.2 HE 染色測定結直腸癌和癌旁組織中APE1 蛋白表達將結直腸癌和癌旁組織石蠟切片經脫蠟、抗原修復，采用過氧化氫去除內源性過氧化物酶，封閉液封閉30 min，加入鼠抗人APE1 單克隆抗體（1 ∶300）過夜孵育；加入山羊抗小鼠二抗（1 ∶1 000）孵育1 h，加入DAB 顯色液顯色，顯微鏡下拍照觀察。結果判斷： APE1 陽性產物主要位于細胞核，根據細胞染色程度和陽性細胞染色率判斷陽性細胞。染色程度： 不著色計0 分；淡棕黃色計1 分；深棕褐色計3分；淡棕黃色和深棕褐色之間計2 分。細胞染色率： 染色率≤5%為0 分，染色率＞5%～25%為1 分；染色率＞25%～50%為2 分；染色率＞50%～75%為3 分；染色率＞75%為4 分。細胞染色程度和染色率相乘得到總分： 0 ～3 分為低表達； 4 ～12 分為高表達[4]。

1.3 隨訪

隨訪時間從病理確診開始至患者死亡或隨訪截止時間。隨訪截止時間為2019年9月30日，隨訪方式為門診隨訪或電話隨訪。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0 統計軟件。計數資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗，Kaplan-Meie 法繪制生存曲線，預后影響因素用Cox 比例風險模型分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 APE1 在結直腸癌和癌旁組織中的表達

細胞核呈棕黃色或棕褐色為陽性細胞。APE1 在癌旁組織中低表達，在癌組織中高表達。見圖1。

APE1 在結直腸癌和癌旁組織中的表達率比較，經χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=42.388，P=0.000），APE1 在結直腸癌組織中的表達率高于癌旁組織（71.00% VS 25.00%）。

圖1 APE1 在結直腸癌和癌旁組織中的表達（HE 染色×400）

2.2 APE1 表達與結直腸癌臨床病理特征的關系

APE1 在不同腫瘤大小、腫瘤分期、有無淋巴結轉移及是否遠處轉移的表達比較，經χ2檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），腫瘤直徑≥5 cm、腫瘤分期Ⅲ和Ⅳ期、有淋巴結轉移及有遠處轉移結直腸癌組織中APE1 陽性表達率高于腫瘤直徑＜5 cm、腫瘤分期Ⅰ和Ⅱ期、無淋巴結轉移及無遠處轉移者。APE1在不同年齡、性別、腫瘤位置及分化程度的表達比較，經χ2檢驗，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 APE1 表達與生存率的關系

所有患者中位隨訪時間為45.35 個月（5 ～60 個月），共41 例患者死亡。APE1 高表達組與低表達組總生存率分別為57.14%和82.76%，經Log-rank χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=6.238，P=0.013），APE1 高表達組低于APE1 低表達組。見圖2。

2.4 APE1 對結直腸癌預后的影響

以總生存期為因變量，以單因素分析中差異有統計學意義的腫瘤大小、腫瘤分期、是否淋巴結轉移及是否遠處轉移為自變量，進行一般多因素Cox 比例風險分析，結果顯示APE1 表達、腫瘤分期、淋巴結轉移及遠處轉移為結直腸癌總生存期的獨立影響因素（P＜0.05）。見表3。

表1 不同因素的結直腸癌組織中APE1陽性率比較 （n =100）

圖2 不同APE1 表達結直腸癌患者總生存率曲線

表3 多因素Cox 比例風險分析結直腸癌總生存期影響因素的參數

3 討論

APE1基因定位在14 號染色體上，分為N 端和C端2 個功能區。不同功能區執行不同功能： N 端功能區主要調控氧化還原功能；C 端功能區主要發揮核酸內切酶的功能，其可以促進DNA 修復的進程[5-6]。惡性腫瘤為一種多基因突變引起的疾病，當DNA 修復相關的基因發生突變時，可引起修復相關蛋白功能障礙或者異常表達，導致DNA 鏈不能馬上修復， DNA損傷積累到一定程度時即可導致惡性腫瘤的發生[7-9]。大量DNA 修復基因與惡性腫瘤的發病關系密切。APE1 為DNA 的修復途徑—堿基切除修復途徑中的主要限速酶，APE1 表達異常必然會影響DNA 修復，從而導致惡性腫瘤等疾病的發生[10-11]。多種惡性腫瘤中APE1 表達異常，在惡性腫瘤的發生、發展中發揮重要作用。SUN 等[12]研究發現，APE1 在肝細胞癌中表達升高，可影響肝癌細胞的增殖和凋亡。YANG 等[13]研究發現，APE1 在非小細胞肺癌中可影響上皮間質轉化。YUAN 等[14]研究發現，APE1 過表達與惡性腫瘤的不良預后關系密切。

APE1基因與結直腸癌的關系也受到大家關注。WANG 等[15]發現，血清APE1-Aabs 在大腸癌的診斷中具有一定臨床價值。吉祖進等[16]發現，APE1 可影響結直腸癌細胞增殖。BALLISTA-HERNáNDEZ等[17]發現，APE1 在致癌物誘導的大腸癌中具有保持線粒體DNA 完整性的作用。LAI 等[18]發現，臺灣地區APE1多態性與大腸癌的患病風險關系密切。本文對APE1 蛋白在結直腸癌組織中的表達及其與臨床病理特征及預后的關系進行研究，發現結直腸癌組織中APE1 陽性表達率升高，表明APE1 參與結直腸癌的發病過程。APE1 陽性率與結直腸癌患者的腫瘤大小、臨床分期、淋巴結轉移及遠處轉移關系密切，表明APE1 與結直腸癌的侵襲、轉移有關。結合上述既往研究及本研究結果，分析APE1 作為堿基切除修復途徑的主要限速酶，其表達升高可影響結直腸癌細胞DNA 修復，從而導致結直腸癌的發生、發展。APE1 可能通過影響結直腸癌細胞的增殖、凋亡及上皮間質轉化等影響結直腸癌細胞的生長特性，從而影響結直腸癌的惡性程度。APE1 高表達組總生存率降低，APE1 為結直腸癌患者生存期的獨立影響因素，表明APE1 為結直腸癌預后評估指標，結直腸癌組織中APE1 高則預后差。分析結直腸癌患者APE1 陽性率與結直腸癌的腫瘤分期、淋巴結轉移及遠處轉移等侵襲轉移惡性關系密切，其陽性率越高，結直腸癌惡性程度越高，故患者預后越差，生存率越低。關于APE1在結直腸癌發生、發展中的具體作用機制，尚需行動物實驗和細胞研究進一步探討。

綜上所述，結直腸癌組織中APE1 高表達，APE1表達與結直腸癌的惡性程度有關，APE1 有望成為結直腸癌的治療靶標和預后評估指標。