人參皂苷Rg1對阿霉素引起的血管內皮細胞損傷的作用及機制研究

馬鉑涵，韓兵，劉婷，王一，黃建華，陶貴周

（1.錦州醫科大學附屬第一醫院，遼寧 錦州 121000；2.青島市即墨區中醫醫院，山東 青島 266200）

阿霉素是一種抗腫瘤抗生素，抗瘤譜較廣，對乳腺癌等腫瘤有一定療效?？墒?，阿霉素具有許多副作用，最明顯的為心臟毒性[1-2]。阿霉素誘導的心肌細胞損傷的主要特征是心肌細胞內活性氧（reactive oxygen species,ROS）引起的細胞凋亡[3-4]。目前關于阿霉素可引起心臟毒性的研究側重于心肌細胞在阿霉素損傷心臟中的作用，而對血管內皮細胞在阿霉素損傷心臟中的作用研究較少。近來研究發現血管內皮細胞在阿霉素損傷心臟中起重要作用[5]。有文獻報道人參皂苷Rg1 對血管內皮細胞具有保護作用[6-7]。近期研究發現Rg1 可以防止阿霉素引起的心臟毒性[8]。提示Rg1 除了保護心肌細胞外，還可能通過保護心臟血管內皮細胞從而防止阿霉素對心臟產生的損傷。本實驗通過體外阿霉素損傷血管內皮細胞，觀察人參皂苷Rg1 對阿霉素損傷后的血管內皮細胞增殖、遷移、小管形成、凋亡及ROS 的影響，并初步探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人臍靜脈血管內皮細胞（human umbilical vein vascular endothelial cells,HUVECs）購自中國科學院上海細胞庫。人參皂苷Rg1 購自南京景竹生物科技有限公司，阿霉素購自美國APExBIO 公司，DMEM-F12培養基購自美國Hyclone 公司，胎牛血清購自美國CLARK Bioscience 公司，胰酶購自加拿大Gibco 公司，Matrigel 購自美國BD 公司，Annexin V-FITC/PI 購自北京四正柏公司，Hochst33342、NO 熒光指示染料DAF-FM DA、超氧化物陰離子熒光探針及MTT 購自上海碧云天生物技術有限公司，p-Akt、Akt、Bcl-2、p-ERK、ERK、p-eNOS、eNOS、Actin 及二抗均購自美國CST 公司。

1.2 分組

本研究分為正常組（未做任何處理）、阿霉素組（0.5μg/ml）、阿霉素+Rg1 組（0.5μg/ml 阿霉素+200μg/ml Rg1），阿霉素的用藥劑量及作用時間點均參考LORENZO 等[9]的方法。

1.3 MTT 法

待HUVECs 生長至90%～95%豐度時，消化、計數接種于96 孔板中（5 000 個/孔）。各組藥物處理48 h 后行MTT 法檢測，觀察人參皂苷Rg1 對血管內皮細胞增殖的影響。

1.4 劃痕實驗

將消化、計數的HUVECs 按照4.0×105個/孔接種于6 孔板中，待細胞生長至90%～95%豐度時，用200μl 槍頭在培養皿底垂直劃一道痕，輕輕吸去細胞碎片及培養基，PBS 沖洗1 遍。分別在藥物處理0、48 h 后用倒置顯微鏡拍照觀察人參皂苷Rg1 對血管內皮細胞遷移的影響。

1.5 小管形成實驗

提前一晚將小管形成實驗所需的Matrigel 基質膠、24 孔板、200μl 槍頭放置于4℃冰箱過夜備用。次日，取200μl Matrigel 基質膠緩慢鋪于24 孔板中（防止產生氣泡），放置培養箱中孵育30 min 后，每孔加入1.0×105個HUVECs 和1 000μl 完全培養基。在37℃、5%二氧化碳條件下孵育6 ～8 h，用倒置顯微鏡進行跟蹤拍照，觀察人參皂苷Rg1 對血管內皮細胞小管形成的影響。

1.6 流式細胞術

將HUVECs 按4.0×105個/孔接種于6 孔板中，藥物處理48 h 后進行Hochst33342 染色，觀察人參皂苷Rg1 對阿霉素引起的血管內皮細胞凋亡的影響。為進一步明確人參皂苷Rg1 對阿霉素引起的血管內皮細胞凋亡的影響，消化并收集血管內皮細胞（5.0×105個/孔），重懸后進行Annexin V-FITC/PI 染色，用流式細胞儀檢測人參皂苷Rg1 對血管內皮細胞凋亡的影響。

1.7 NO 及ROS 檢測

將HUVECs 按4.0×105個/孔接種于6 孔板中，藥物處理48 h 后進行NO 和ROS 檢測。檢測NO 時，將HUVECs 加入含DAF-FMDA（5μmol/L）的溶液，在室溫下孵育30 min。檢測ROS 時，將HUVECs 加入含超氧化物陰離子熒光探針（5μmoL/L）的溶液，室溫下孵育30 min，在倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.8 Western blotting 檢測

將培養的HUVECs 用藥物處理48 h 后，收取細胞并提取蛋白，進行BCA 蛋白定量及制樣。依據不同目的蛋白分別配置10%或12% SDS-PAGE，PVDF 膜轉膜，洗膜液清洗1 次，5 min/次，封閉2 h，分別加入Bcl-2、ERK、p-ERK、Akt、p-Akt、eNOS 及p-eNOS一抗4℃孵育過夜，次日洗膜液清洗3 次，5 min/次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育2 h，洗膜液清洗3 次，5 min/次，加入化學發光液曝光顯影，觀察人參皂苷Rg1 對凋亡通路及p-Akt/p-eNOS 信號通路的影響。

1.9 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人參皂苷Rg1 提高阿霉素損傷的血管內皮細胞的活性

MTT 法結果顯示，正常組、阿霉素組和阿霉素+Rg1組細胞活性分別為（100.00±0.00）%、（37.89±6.17）%和（56.51±7.23）%，經方差分析，差異有統計學意義（F=179.649，P=0.000）。與正常組比較，阿霉素組細胞活性降低（P＜0.05）；與阿霉素組比較，阿霉素+Rg1 組能提高血管內皮細胞的活性（P＜0.05）。見圖1。

圖1 人參皂苷Rg1 對阿霉素損傷的血管內皮細胞活性的影響 （±s）

2.2 人參皂苷Rg1 改善阿霉素損傷的血管內皮細胞遷移及小管形成狀態

各組細胞遷移率、血管形成交叉點數比較,差異有統計學意義（P＜0.05）。與正常組比較，阿霉素組細胞遷移率、血管形成交叉點數降低（P＜0.05）；與阿霉素組比較，阿霉素+Rg1 組能夠改善受損傷血管內皮細胞的遷移及小管形成狀態（P＜0.05）。見表1和圖2、3。

表1 各組細胞遷移率、血管形成交叉點數比較 （±s）

表1 各組細胞遷移率、血管形成交叉點數比較 （±s）

注： ①與正常組比較，P ＜0.05；②與阿霉素組比較，P ＜0.05。

組別 遷移率/% 血管形成交叉點數正常組 81.598±4.416 122.600±10.615阿霉素組 49.211±3.181① 46.800±5.973①阿霉素+Rg1 組 72.132±6.655② 108.200±7.302②F 值 103.463 144.003 P 值 0.000 0.000

圖2 人參皂苷Rg1 對阿霉素損傷的血管內皮細胞遷移的影響 （×40）

圖3 人參皂苷Rg1 對阿霉素損傷的血管內皮細胞小管形成的影響 （×40）

2.3 人參皂苷Rg1 減少阿霉素損傷的血管內皮細胞的凋亡

Hochst33342 染色顯示，藥物作用48 h 后，正常組細胞核呈淺藍色；阿霉素組細胞核染色質濃縮并分裂，明顯發亮；阿霉素+Rg1 組相對于阿霉素組，亮藍色斑點明顯減少。提示人參皂苷Rg1 對阿霉素損傷的血管內皮細胞的凋亡有保護作用。見圖4。

流式細胞術結果顯示，正常組、阿霉素組和阿霉素+Rg1 組細胞凋亡率分別為（2.16±0.36）%、（17.07±1.30）%和（6.65±0.47）%，經方差分析，差異有統計學意義（F=259.132，P=0.000）。與阿霉素組比較，阿霉素+Rg1 組減少阿霉素引起的細胞凋亡（P＜0.05）。見圖5、6。

2.4 人參皂苷Rg1 對阿霉素損傷后血管內皮細胞ROS 及NO 水平的影響

圖4 人參皂苷Rg1 對阿霉素損傷的血管內皮細胞的Hochst33342 染色結果 （×200）

圖5 人參皂苷Rg1 對阿霉素損傷的血管內皮細胞凋亡的影響

圖6 各組細胞凋亡率比較 （±s）

DAF-FMDA 是一種NO 定量檢測的熒光探針，NO 含量越高綠色熒光表達越強。超氧化物陰離子熒光探針是最常用的檢測細胞內超氧化物陰離子水平的熒光探針，當細胞內的超氧化物陰離子水平較高時，紅色熒光較強，反之則較弱。各組藥物處理48 h 后NO 及ROS 平均熒光強度比值比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。與阿霉素組比較，阿霉素+Rg1 組阿霉素損傷后的血管內皮細胞NO 升高，ROS 減少。見表2和圖7。

表2 各組藥物處理48 h 后NO 及ROS 水平比較 （±s）

表2 各組藥物處理48 h 后NO 及ROS 水平比較 （±s）

注： ①與正常組比較，P ＜0.05；②與阿霉素組比較，P ＜0.05。

組別 NO ROS正常組 1.000±0.000 1.000±0.000阿霉素組 0.282±0.046① 2.730±0.294①阿霉素+Rg1 組 1.752±0.207①② 1.752±0.238①②F 值 108.088 47.445 P 值 0.000 0.000

2.5 人參皂苷Rg1 對阿霉素損傷后血管內皮細胞Bcl-2、p-ERK、p-Akt 及p-eNOS 蛋白相對表達量的影響

藥物作用48 h 后，各組Bcl-2、p-ERK、p-Akt及p-eNOS 蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。阿霉素組較正常組低（P＜0.05），阿霉素+Rg1 組較阿霉素組高（P＜0.05）。見表3和圖8。

圖7 人參皂苷RG1 對阿霉素所致血管內皮細胞損傷后ROS 及NO 水平的影響 （×200）

表3 各組Bcl-2、p-ERK、p-Akt 及p-eNOS 蛋白相對表達量比較 （±s）

表3 各組Bcl-2、p-ERK、p-Akt 及p-eNOS 蛋白相對表達量比較 （±s）

注： ①與正常組比較，P ＜0.05；②與阿霉素組比較，P ＜0.05。

組別 Bcl-2 p-ERK p-Akt p-eNOS正常組 0.605±0.025 1.750±0.228 1.056±0.121 0.870±0.054阿霉素組 0.261±0.015① 0.522±0.062① 0.418±0.085① 0.187±0.021①阿霉素+Rg1 組 0.390±0.015② 0.858±0.115② 0.794±0.057② 0.866±0.054②F 值 263.263 70.621 37.745 222.906 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖8 人參皂苷Rg1 對阿霉素損傷的血管內皮細胞相關蛋白的影響

3 討論

阿霉素對心臟的毒性作用表現為急性和慢性損害，導致左心功能下降、擴張型心肌病和心力衰竭。心肌細胞的ROS 及凋亡是阿霉素誘導的細胞損傷的主要特征[3-4]。多種藥物可預防阿霉素引起的心臟毒性，如抗氧化劑、金屬螯合劑、血管緊張素轉換酶和β 受體阻滯劑，并取得了一定程度的成功[4、10-12]。有學者報道，藥用植物能預防阿霉素引起的心臟毒性[13-15]。從植物中尋找防止阿霉素心臟毒性的天然化合物，對降低阿霉素對化療患者心臟毒性具有重要的臨床意義。

人參是一種著名的傳統中藥，因具有強身健體及滋補作用而被人們廣泛使用。人參的主要活性成分是人參皂苷，包括Rg1、Rg3、Rh1、Re 和Rd。一些研究表明，Rg1 能防止心臟缺血再灌注損傷，縮小心臟的梗死面積，防止心臟病理性重塑[16-18]。最近研究發現Rg1 可以防止阿霉素引起的心臟毒性。其通過促進Akt 和ERK 的磷酸化，增加Bcl-2 和Bax 的比例，減少細胞色素C 從線粒體釋放入胞漿，從而抑制阿霉素引起的心臟細胞凋亡[8]。

既往研究主要注重阿霉素對心肌細胞的損傷，而對血管內皮細胞損傷的研究較為少見。因為血管內皮細胞在心臟病理、生理過程中起重要作用，而阿霉素對血管內皮細胞也具有毒性作用，所以減輕阿霉素引起的血管內皮細胞損傷對保護心臟具有重要意義。R?S?NEN 等[5]報道，VEGF-B基因可以通過保護血管內皮細胞抑制阿霉素引起的心臟毒性。而有學者報道Rg1 對血管內皮細胞具有保護作用[6-7]。提示Rg1可以通過保護血管內皮細胞防止阿霉素引起的心臟損傷。本研究發現人參皂苷Rg1 可防止阿霉素引起的心臟血管內皮細胞損傷，包括促進血管內皮細胞增殖、遷移及小管形成，減少ROS 及阿霉素引起的血管內皮細胞凋亡。

ROS 在細胞凋亡中起重要作用。BUCCELLATO等[19]發現，鼠原始細胞上皮細胞暴露于高氧狀態導致ROS 產生，同時導致線粒體膜上BAX 的激活、細胞色素C 的釋放和細胞凋亡。BAI 等[20]發現，芝麻素通過激活Akt 和ERK，防止因ROS 產生的結腸炎。NO作為一種信號分子，在細胞的生理和病理過程中起重要作用；eNOS 作為NO 誘導合成的限速酶，在抑制細胞凋亡中起重要作用[21]。MU 等[22]研究發現，阿霉素抑制eNOS 表達，引起ROS 增多，而熊果酸通過升高eNOS，抑制ROS，保護阿霉素引起的心臟損傷?；罨疉kt/eNOS，減少ROS，減少炎癥引起的血管內皮細胞凋亡[23]；而ERK 通路活化在堿性成纖維細胞生長因子保護腦微血管細胞中起重要作用[24]。本研究發現人參皂苷Rg1 提高Bcl-2、p-Akt、p-ERK 及p-eNOS 的相對表達量，提示人參皂苷Rg1 可能通過增加Bcl-2、p-Akt、p-ERK 及p-eNOS 表達從而減輕阿霉素對血管內皮細胞的損傷。

綜上所述，人參皂苷Rg1 可減輕阿霉素引起的血管內皮細胞損傷，可能的機制為通過增加Bcl-2、p-Akt、p-ERK 及p-eNOS 表達從而減輕阿霉素對血管內皮細胞的損傷。