慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者血清microRNA-146a水平及其臨床意義

王美華，陳麗琴

（杭州市西溪醫(yī)院 1.呼吸內(nèi)科，2.肺功能室，浙江 杭州 310023）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease,COPD）為常見的呼吸道疾病，對(duì)人們的健康造成嚴(yán)重危害。慢性阻塞性肺疾病急性加重期（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease,AECOPD）是COPD 死亡的主要原因。AECOPD 由多種原因引起，呼吸道感染是導(dǎo)致AECOPD 發(fā)生的主要原因，呼吸道感染主要以細(xì)菌感染為主[1]。呼吸道感染可引起機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致血清免疫炎癥細(xì)胞因子水平發(fā)生變化[2]。MicroRNA（miRNA）為一類非編碼單鏈RNA，長(zhǎng)度為20 ～23 個(gè)核苷酸，具有多種生理病理功能[3]。miRNA-146a 是一個(gè)可以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的miRNA，在免疫炎癥反應(yīng)中也發(fā)揮重要作用[4]。AECOPD 主要由呼吸道感染引起，但miRNA-146a 是否參與AECOPD 的發(fā)病過程尚不清楚。本文對(duì)AECOPD 患者血清miRNA-146a 水平進(jìn)行研究，探討其在AECOPD 中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2019年1月—2019年12月在杭州市西溪醫(yī)院就診的150 例AECOPD 患者作為AECOPD 組，同期本院健康體檢者150 例作為對(duì)照組。診斷標(biāo)準(zhǔn)： AECOPD 診斷參照《慢性阻塞性肺疾病全球倡議2019》[5]。納入標(biāo)準(zhǔn)： ①AECOPD 患者符合AECOPD的診斷標(biāo)準(zhǔn)，入院前30 d 內(nèi)未服用抗菌藥物或糖皮質(zhì)激素治療，入院前7 d 未服用支氣管擴(kuò)張及影響研究結(jié)果藥物；②對(duì)照組經(jīng)胸片或胸部CT 檢查無(wú)肺氣腫、慢性支氣管炎等肺部疾病表現(xiàn)；③均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)： ①活動(dòng)性肺結(jié)核、支氣管擴(kuò)張、肺間質(zhì)性疾病、支氣管哮喘、氣胸、胸膜粘連及胸腔積液等其他肺部疾病；②胸部CT 或胸片顯示肺炎；③心肌梗死、心肌疾病、心力衰竭及風(fēng)濕性心臟病等心臟疾病；④免疫性疾病；⑤糖尿病等內(nèi)分泌疾病；⑥惡性腫瘤；⑦急慢性感染性疾病；⑧肺葉切除術(shù)病史；⑨嚴(yán)重心、肝、腎功能異常。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。兩組性別、年齡、身高、體重指數(shù)（BMI）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而吸煙指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），AECOPD 組高于對(duì)照組。AECOPD 患者28 d 內(nèi)死亡28 例，存活122 例。

表1 兩組一般資料比較 （n =150）

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集抽取AECOPD 患者和對(duì)照組體檢者清晨空腹外周靜脈血5 ml，5 200 r/min 離心10 min，取上層血清備用。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）測(cè)定血清miRNA-146a 水平應(yīng)用Trizol 法提取血清總RNA。將總RNA 逆轉(zhuǎn)為cDNA，以U6 為內(nèi)參，PCR 儀測(cè)定血清miRNA-146a 水平，PCR 反應(yīng)條件： 94℃預(yù)變性10 min，94℃變性10 s，60℃退火1 min，45℃延伸1 min，共計(jì)42 個(gè)循環(huán)。血清miRNA-146a 水平以2-ΔΔct法表示。PCR 儀購(gòu)自德國(guó)Analytikjena 公司，試劑購(gòu)自丹麥EXIQON 公司。miRNA-146a 正向引物： 5'-GCTGAGAACTGAATTCCATGGGT-3'；反向引物為試劑盒通用引物，引物長(zhǎng)度為25 bp。

1.2.3 血清C 反應(yīng)蛋白（C-reactive protein,CRP）、降鈣素原（Procalcitonin,PCT）及白細(xì)胞介素-6（interleukin-6,IL-6）水平測(cè)定采用免疫速率散射比濁法測(cè)定CRP 水平；采用免疫層析法測(cè)定PCT水平；采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定IL-6水平。

1.2.4 肺功能測(cè)定采用德國(guó)耶格公司Master Screen肺功能儀測(cè)定患者肺功能，包括第一秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second,FEV1）和用力肺活量（forced vital capacity,FVC）。計(jì)算FEV1/FVC 值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)或方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析用Pearson 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miRNA-146a、CRP、PCT 及IL-6 水平比較

兩組血清miRNA-146a、CRP、PCT 及IL-6 水平比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），AECOPD 組高于對(duì)照組。見表2。

表2 兩組血清miRNA-146a、CRP、PCT 及IL-6 水平比較 （n =150，±s）

表2 兩組血清miRNA-146a、CRP、PCT 及IL-6 水平比較 （n =150，±s）

組別 miRNA-146a CRP/（mg/L） PCT/（ng/ml） IL-6/（pg/ml）對(duì)照組 1.00±0.08 4.57±1.14 0.03±0.01 5.18±1.24 AECOPD 組 2.31±0.24 21.53±2.04 0.32±0.05 61.34±4.35 t 值 63.420 88.885 69.656 152.061 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 兩組肺功能指標(biāo)比較

兩組FEV1、FVC 及FEV1/FVC 比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），AECOPD 組低于對(duì)照組。見表3。

表3 兩組肺功能指標(biāo)比較 （n =150，±s）

表3 兩組肺功能指標(biāo)比較 （n =150，±s）

組別 FEV1/L FVC/L FEV1/FVC/%對(duì)照組 1.77±0.22 3.48±0.37 74.98±9.02 AECOPD 組 1.18±0.17 2.41±0.46 52.35±8.67 t 值 25.990 22.199 22.153 P 值 0.000 0.000 0.000

2.3 不同臨床特征患者血清miRNA-146a 水平比較

不同性別、年齡及是否戒煙患者血清miRNA-146a 水平比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而不同肺功能分級(jí)患者血清miRNA-146a水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；隨著肺功能分級(jí)升高，血清miRNA-146a 水平升高（P＜0.05）。死亡和存活患者血清miRNA-146a 水平比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），死亡患者高于存活患者。見表4。

表4 不同臨床特征患者血清miRNA-146a 水平比較（±s）

表4 不同臨床特征患者血清miRNA-146a 水平比較（±s）

因素 n miRNA-146a t/F 值 P 值性別男134 2.30±0.27 0.570 0.570女16 2.34±0.22年齡≥65 歲 82 2.30±0.28 0.664 0.508＜65 歲 68 2.33±0.27是否戒煙是92 2.29±0.32 0.579 0.563否58 2.32±0.29肺功能分級(jí)Ⅰ級(jí) 29 1.78±0.21Ⅱ級(jí) 45 2.14±0.25Ⅲ級(jí) 41 2.37±0.23Ⅳ級(jí) 35 2.58±0.24預(yù)后死亡 28 2.54±0.25 68.375 0.000 11.391 0.000存活 122 2.02±0.21

2.4 AECOPD 患者血清miRNA-146a 水平與其他指標(biāo)的相關(guān)性

AECOPD 患者血清miRNA-146a 水平與血清CRP、PCT 及IL-6 水平呈正相關(guān)（P＜0.05）；而與FEV1、FVC 及FEV1/FVC 呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。見表5。

表5 AECOPD 患者血清miRNA-146a 水平與其他指標(biāo)的相關(guān)性

3 討論

COPD 的發(fā)生主要是由香煙煙霧或其他生物燃料產(chǎn)生的煙霧持續(xù)暴露所導(dǎo)致的肺部慢性炎癥。慢性炎癥產(chǎn)生肺氣腫，阻止免疫機(jī)制和正常的修復(fù)過程，導(dǎo)致小氣道纖維化。上述病理變化導(dǎo)致氣流進(jìn)行性受阻，出現(xiàn)呼吸困難等COPD 相關(guān)的臨床癥狀。AECOPD是COPD 患者在受到感染或其他因素影響所導(dǎo)致的喘息、咳嗽及咳痰癥狀突然加重，肺功能急劇下降[6]。AECOPD 患者呼吸道感染可引起機(jī)體免疫炎癥系統(tǒng)異常，免疫炎癥反應(yīng)在AECOPD 發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[7]。

miRNA-146a 在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及T 淋巴細(xì)胞等多種炎癥和免疫細(xì)胞中高表達(dá)，是一種與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切的miRNA[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-146a 啟動(dòng)序列中含有核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）結(jié)合位點(diǎn)[10]。IL-6 等多種免疫炎癥相關(guān)細(xì)胞因子通過NF-κB 依賴方式促進(jìn)miRNA-146a 的表達(dá)。NF-κB 為參與炎癥反應(yīng)的主要信號(hào)通路，可反過來調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)[11-12]，如miRNA-146a 參與幼鼠細(xì)菌性腦膜炎的炎癥反應(yīng)過程[13]，miRNA-146a 參與癲癇大鼠炎癥反應(yīng)過程[14]。miRNA-146a 也通過免疫炎癥反應(yīng)參與肺損傷過程，改善miRNA-146a 的活性可以改善脂多糖誘導(dǎo)的肺部炎癥反應(yīng)，降低miRNA-146a 表達(dá)可保護(hù)COPD 誘導(dǎo)的肺損傷[15]。miRNA-146a 在COPD 中的作用也受到大家關(guān)注，ZHOU 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-146a 單核苷酸多態(tài)性影響COPD 患者的肺功能。CHEN 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)中miRNA-146a 與COPD的炎癥細(xì)胞因子有關(guān)，可預(yù)測(cè)COPD 急性加重的風(fēng)險(xiǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，AECOPD 患者血清miRNA-146a、CRP、PCT 及IL-6 水平升高，AECOPD患者血清miRNA-146a 水平與血清CRP、PCT 及IL-6 水平呈正相關(guān)，表明miRNA-146a 通過炎癥反應(yīng)參與AECOPD的發(fā)病過程。結(jié)合既往研究結(jié)果，分析AECOPD 患者CRP、PCT 及IL-6 等炎癥細(xì)胞因子水平升高，炎癥細(xì)胞因子激活NF-κB 等炎癥相關(guān)信號(hào)通路，激活的NF-κB 與miRNA-146a 啟動(dòng)序列中含有NF-κB 結(jié)合位點(diǎn)，通過NF-κB 依賴方式促進(jìn)miRNA-146a 的表達(dá)，導(dǎo)致miRNA-146a 水平升高，參與機(jī)體炎癥反應(yīng)過程，導(dǎo)致肺損傷。檢測(cè)血清miRNA-146a 水平可在一定程度上反映AECOPD患者的機(jī)體炎癥反應(yīng)程度。

本研究顯示，AECOPD 患者FEV1、FVC 及FEV1/FVC 值降低，AECOPD 患者血清miRNA-146a 水平與FEV1、FVC 及FEV1/FVC 呈負(fù)相關(guān)，表明AECOPD 患者肺功能下降，miRNA-146a 水平在一定程度上可反映患者肺功能情況。本研究對(duì)不同臨床特征AECOPD患者miRNA-146a 水平的研究結(jié)果顯示，隨著肺功能分級(jí)升高，血清miRNA-146a 水平升高，死亡患者血清miRNA-146a 水平高于存活患者，表明檢測(cè)血清miRNA-146a 水平在一定程度上可反映AECOPD 患者的病情和預(yù)后。

綜上所述，AECOPD 患者血清miRNA-146a 水平升高，檢測(cè)血清miRNA-146a 水平對(duì)評(píng)估患者機(jī)體炎癥反應(yīng)程度、肺功能、病情嚴(yán)重程度和預(yù)后具有一定的指導(dǎo)價(jià)值。