MicroRNA-381靶向調控KLF-4抗腎纖維化的機制研究

王立成，李現鐸，陳冬冬，唐冠寶，門同義

（山東大學附屬千佛山醫院 泌尿外二科，山東 濟南 250014）

腎間質纖維化是各種慢性腎臟疾病終末期的共同病變過程。因腎小管上皮-間質細胞轉化，正常的腎臟結構被細胞外基質（extracellular matrix,ECM）替代。KLF-4 抑制多種細胞上皮-間質細胞轉化，調控腎纖維化發展進程[1-5]。研究發現，MicroRNA（miRNA）是纖維化發生、發展過程中細胞生物學功能的主要調控者[6-8]。本研究旨在分析miR-381 與KLF-4 在腎纖維化發展進程中的調控關系，為診斷及治療腎纖維化提供新的研究方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年2月—2017年12月山東大學附屬千佛山醫院收治的106 例腎纖維化患者。其中，男性59 例，女性47 例；平均年齡（53.42±12.15）歲。所有患者無泌尿系感染、糖尿病及惡性腫瘤。收集同期本院健康體檢者100 例作為對照組。其中，男性50 例，女性50 例；平均年齡（52.35±10.33）歲。

1.2 外周血采集

采用美國BD 公司一次性血清分離膠管，所有納入患者及健康體檢者于清晨空腹狀況下抽取外周靜脈血約3 ml，靜置。待血清析出后，使用臺式離心機以1 500 r/min 離心10 min，取上層血清，凍存至-80℃冰箱待檢測。

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應

采用美國Invitrogen 公司Trizol 試劑盒提取總RNA，將提取到的總RNA 按照逆轉錄試劑盒說明書進行RNA 逆轉錄，合成cDNA。應用美國ABI 公司StepOne Plus 實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）儀，嚴格按照日本TaKaRa 公司SYBR Premix Ex Taq PCR 反應試劑盒的操作說明書進行PCR 反應。

1.4 細胞培養和轉染

NRK49F 細胞購自中國科學院上海細胞庫，在10%磷酸鹽緩沖液（PBS）的DMEM-LG 培養基中，37℃、95%空氣、5%二氧化碳的細胞恒溫培養箱中孵育培養。當細胞生長至覆蓋率達85%時，進行細胞傳代。傳代過程中，棄去原DMEM-LG 培養基，無菌PBS 洗3 次，再用0.25%胰酶消化1 min。在倒置顯微鏡下觀察細胞消化過程，待細胞變圓、邊緣變亮后，加入含10% PBS 的DMEM 培養基終止消化并將細胞按照1∶3 的比例進行傳代。將細胞分為miR-381 組、NC 組、Ang Ⅱ組、空白組。miR-381 組按照說明書將miR-381mimics 轉染進NRK49F 細胞；NC組按照說明書將negative control miRNA mimics 轉染進NRK49F細胞；AngⅡ組將AngⅡ作用于NRK49F細胞；空白組未做任何處理。

1.5 熒光素酶報告分析

構建KLF-4 野生型3’-UTR 熒光素酶報告基因質粒pMIR-WT，并以pMIR-WT 質粒為模板，利用PCR 搭橋法構建其潛在結合位點突變型報告基因質粒pMIR-MUT。用pMIR-WT 或pMIR-MUT 分別轉染miR-381 組和NC 組NRK49F 細胞。在細胞培養箱中培養36 h 后，用Passive lysis buffer 裂解細胞后分析雙熒光素酶活性。

1.6 Western blotting

棄去培養皿中DMEM 細胞培養液，以預冷的無菌PBS 清洗細胞3 次，棄去PBS，向培養皿中加入蛋白裂解液200μl，充分震蕩，用細胞刮收集細胞至1.5 ml EP 管中，4℃、15 000 r/min 離心10 min，上清液即為細胞全蛋白。通過聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，按說明書進行Western blotting 檢測。

1.7 復制單側輸尿管梗阻小鼠模型

24 只BACB/c 小鼠，雌雄不限，鼠齡6 ～8 周，體重18 ～20 g，由山東大學附屬千佛山醫院動物實驗中心提供，動物許可證號： SYXK（魯）20180009。將24 只小鼠隨機分為假手術組、單側輸尿管梗阻（UUO）組及UUO+miR-381 組，每組8 只。小鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.004 ml/g）麻醉約2 min 后，取仰臥位固定。術前消毒，于無菌條件下，取腹部正中白線為手術切口。UUO 組和UUO+miR-381 組尋找左側輸尿管并鈍性分離輸尿管至腎門，于小鼠腎臟下極和腎門處分別用絲線結扎左側輸尿管，并于兩結扎處之間剪斷輸尿管。右側輸尿管不予任何處理，縫合腹膜，消毒，縫合腹直肌和皮膚，再次消毒。假手術組小鼠除不結扎輸尿管外，其余操作與上述相同。UUO+miR-381 組尾靜脈注射40 mg/kg miR-381mimics 1 次/3 d，假手術組和UUO 組尾靜脈注射等量生理 鹽水。

1.8 Masson 染色

切取小鼠腎臟標本并用固定液固定，浸蠟包埋，固定于切片機上切成3 ～5μm 薄片，按照說明書分別采用蘇木精-伊紅染色和Masson 染色對3 組小鼠腎臟纖維化進行分析。

1.9 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用獨立樣本t檢驗或單因素方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-381 在腎纖維化患者及小鼠UUO 模型體內的表達

qRT-PCR 結果表明，miR-381 在腎纖維化患者、對照組血清中的相對表達量分別為（0.324±0.047）和（1.000±0.122），經t檢驗，差異有統計學意義（t=53.035，P=0.000），腎纖維化患者低于對照組。UUO 組、假手術組小鼠腎臟組織中miR-381 相對表達量分別為（0.417±0.062）和（1.000±0.208），經t檢驗，差異有統計學意義（t=12.030，P=0.000），UUO組低于假手術組。

2.2 Ang Ⅱ抑制NRK49F 細胞中miR-381 的表達

Ang Ⅱ組和空白組miR-381 相對表達量分別為（0.324±0.047）和（1.000±0.122），經t檢驗，差異有統計學意義（t=53.035，P=0.000），經Ang Ⅱ刺激后miR-381 在NRK49F 細胞的相對表達量低于 空白組。

2.3 miR-381 抑制α-SMA 的表達

miR-381 組、Ang Ⅱ組、空白組α-SMA 相對表達量為（0.762±0.089）、（1.127±0.154）、（0.519± 0.073），經方差分析，差異有統計學意義（F=7.321，P=0.023），AngⅡ組高于miR-381組和空白組（t=3.554和6.179，P=0.024 和0.004）。

2.4 KLF-4 是miR-381 的靶基因

通過miRNA 靶基因數據庫Targetscan 進行篩選預測，確定miR-381 的潛在靶基因為KLF-4（見圖1）。雙熒光素酶檢測結果顯示，miRNA-381 組與NC 組pMIR-WT 熒光活性分別為（0.437±0.043）和（1.000±0.126），經t檢驗，差異有統計學意義（t=7.324，P=0.002），miRNA-381 組低于NC 組；miRNA-381 組與NC 組pMIR-MUT 熒光活性分別為（0.951±0.012）和（1.121±0.164），差異無統計學意義（t=1.791，P=0.148）。miR-381 可結合KLF-4 的3'-UTR 并抑制KLF-4的表達。

2.5 miR-381 負向調控KLF-4 mRNA 和蛋白的表達

qRT-PCR 結果顯示，miR-381 組、NC 組KLF-4 mRNA 相對表達量分別為（0.335±0.029）和（1.000± 0.174），經t檢驗，差異有統計學意義（t=6.530，P=0.003），miR-381 組低于NC 組。

Western blotting 檢測結果顯示，miR-381 組、NC組KLF-4 蛋白相對表達量分別為（0.166±0.074）和（0.385±0.049），經t檢驗，差異有統計學意義（t=4.274，P=0.013），miR-381 組低于NC 組（見圖2）。miR-381 能靶向調控KLF-4，且抑制KLF-4 mRNA 和蛋白的表達。

圖1 miR-381 與靶基因KLF-4 的序列關系

圖2 兩組KLF-4 蛋白的表達

2.6 miR-381 抑制腎纖維化因子mRNA 的表達

NC 組與miR-381 組腎纖維化因子α-SMA、CTGF、COL1A1 及COL3A1 mRNA 相對表達量比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），miR-381 組均低于NC 組。miR-381 能干擾TGF-β 信號通路，從而抑制腎纖維化的發展進程。見表1。

表1 兩組腎纖維化因子mRNA 的相對表達量比較 （±s）

表1 兩組腎纖維化因子mRNA 的相對表達量比較 （±s）

組別 α-SMA mRNA CTGF mRNA COL1A1 mRNA COL3A1 mRNA NC 組 1.000±0.162 1.000±0.117 1.000±0.134 1.000±0.091 miR-381 組 0.614±0.076 0.403±0.054 0.482±0.082 0.267±0.045 t 值 3.736 8.025 5.711 12.506 P 值 0.020 0.001 0.005 0.000

2.7 miR-381 抑制UUO 小鼠腎纖維化發展進程

Masson 染色發現，相比UUO 組，UUO+miR-381組小鼠腎纖維化區域減小，ECM 沉積變少（見圖3）。各組COL1A1 和COL3A1 mRNA 相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經LSD-t檢驗，UUO+miR-381 組低于UUO 組（t=5.340 和5.992，P=0.006 和0.004）。miR-381 抑制UUO 小鼠的腎纖維化發展進程。見表2。

表2 3 組小鼠COL1A1 和COL3A1 mRNA 相對表達量比較 （n =8，±s）

表2 3 組小鼠COL1A1 和COL3A1 mRNA 相對表達量比較 （n =8，±s）

組別 COL1A1 mRNA COL3A1 mRNA假手術組 1.117±0.025 1.565±0.038 UUO 組 4.165±0.791 4.854±0.657 UUO+miR-381 組 1.649±0.201 2.411±0.259 F 值 10.023 9.327 P 值 0.004 0.005

圖3 miR-381 對腎纖維化的調控 （Masson 染色×100）

3 討論

腎間質纖維化是腎臟病變的病理基礎和最終途徑，其在多因素作用下，引起炎癥浸潤、成纖維細胞增生及ECM 在腎間質沉積[9]，是腎衰竭特征之一。miRNA 是一類非編碼單鏈小分子RNA，可調控人體30%編碼蛋白基因的表達。左琪等[10]發現，相對于無腎間質纖維化患者，腎間質纖維化患者尿中miR-21 升高，干預治療后miR-21 下降，纖維化程度減輕。劉亞楠等[11]在UUO 大鼠模型中發現miR-192 在纖維化中起促進作用。miRNA 靶點治療可以抑制或阻斷纖維化，避免腎臟替代治療。已有報道證實，miRNA與腎間質纖維化密切相關，但miR-381 在腎間質纖維化中的作用鮮有報道。本研究發現，腎間質纖維化患者血清miR-381 低于對照組，且在UUO 組小鼠腎組織中miR-381 低于假手術組。由此推斷，miR-381 可能參與腎間質纖維化發展進程。

腎損傷時，Ang Ⅱ及其受體在成纖維細胞、系膜細胞中表達上調，刺激成纖維細胞增殖，促使ECM 生成及生長因子分泌，發揮促纖維化作用。α-SMA 表達升高標志上皮細胞向肌成纖維細胞轉化，使腎間質中肌成纖維細胞聚集，導致ECM 合成和分泌增多，促進纖維化形成。本研究通過Ang Ⅱ刺激NRK49F 細胞，發現Ang Ⅱ組miR-381 低于空白組，且α-SMA 高于空白組，但miR-381 組α-SMA 低于Ang Ⅱ組，表明Ang Ⅱ促進NRK49F 細胞中α-SMA 的表達，該作用可被miR-381 抑制。由結果得知miR-381 可抑制α-SMA 表達及Ang Ⅱ誘導的腎間質纖維化。

KLF 家族主要在胃腸道和其他上皮組織終末期細胞中高表達，參與調節正常細胞分化增殖。KLFs 可作為轉錄激活子，或轉錄抑制子，有些KLF 因子兼有兩種功能。研究發現，KLF-4 是調節上皮細胞-間質細胞轉化的關鍵負性調控蛋白[12]。本研究通過miRNA靶基因數據庫預測KLF-4是miR-381 潛在靶基因，采用雙熒光素酶檢測發現miR-381 可抑制KLF-4 的表達，并通過實驗驗證miR-381 可抑制KLF-4 mRNA和蛋白的表達。

CTGF 與腎臟、肺和肝臟等組織器官纖維化進程有關，其在腎臟含量最高。CTGF 是TGF-β 促纖維化信號通路下游因子，刺激細胞增殖及ECM 形成，促進腎間質纖維化[13-14]。ECM 主要成分包括Ⅰ、Ⅲ型膠原，COL1A1 和COL3A1 分別是Ⅰ、Ⅲ型膠原的組成部 分[15]。本研究發現，miR-381 組腎纖維化因子mRNA表達低于NC 組，說明miR-381 抑制KLF-4 表達，并干擾TGF-β 信號通路，抑制腎間質纖維化發展進程。Masson 染色顯示UUO+miR-381 組小鼠腎間質纖維化區域小于UUO 組，ECM 沉積變少，纖維化進程受到抑制。UUO+miR-381 組小鼠COL1A1 和COL3A1 mRNA 低于UUO 組，表明miR-381 可抑制UUO 小鼠腎間質纖維化發展進程。

綜上所述，miR-381 可抑制Ang Ⅱ誘導的腎間質纖維化，并下調腎纖維化基因表達。抑制UUO 小鼠腎間質纖維化，提示miR-381 抑制KLF-4 表達，干擾TGF-β 信號通路，抑制腎間質纖維化發展進程。因此，miR-381 可能成為腎間質纖維化診斷及治療的新 靶點。