雷公藤紅素對卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及作用機(jī)制研究

馬著妍，吳田田，吳彤，王悅，張?zhí)N莉

（錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科，遼寧 錦州 121000）

我國每年約有5.2 萬女性被確診為卵巢癌，約2.2萬人死于卵巢癌，并且過去10年卵巢癌發(fā)病呈年輕化趨勢[1]。卵巢癌具有易增殖、侵襲性高等特點(diǎn)，這也往往是臨床治療失效的原因，因此抑制卵巢癌細(xì)胞增殖及侵襲是治療卵巢癌的要點(diǎn)與難點(diǎn)之一[2-3]。雷公藤紅素是從我國傳統(tǒng)中藥雷公藤中提取的單體，具有良好的安全性。有學(xué)者前期研究發(fā)現(xiàn)，其抑制腫瘤血管生成、腫瘤增殖及侵襲效果較好[4-7]。同時有報道顯示，腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡可以有效抑制腫瘤生長[8-9]。 但是，雷公藤紅素抑制腫瘤生長是否與細(xì)胞凋亡有關(guān)鮮有報道。因此，本研究以人卵巢癌細(xì)胞株HEYa8作為研究對象，研究雷公藤紅素對HEYa8 細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并探究其分子機(jī)制，以期為臨床攻克卵巢癌提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

雷公藤紅素購自上海Aladdin 公司，HEYa8 人卵巢癌細(xì)胞株購自美國ATCC 公司。培養(yǎng)基DMEM 及胎牛血清FBS 均購自美國Gibco 公司，MTT 試劑購自美國ThermoFisher 公司，IGF-1 購自美國R＆D 公司，GSDMS-N 購自美國Santa Cruz Biotechnology 公司，NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-18 及CD44 購自美國Abcam 公司，IL-1β、GAPDH、PI3K 及Akt 購自美國Cell Signaling Technology 公司。

1.2 HEYa8 人卵巢癌細(xì)胞株培養(yǎng)

將含有12%胎牛血清和1%青鏈霉雙抗的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)HEYa8 細(xì)胞，置于37℃、5%二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)換液及傳代。

1.3 MTT 法測定雷公藤紅素處理的最適濃度及時間

把雷公藤紅素濃度分為8 個梯度，分別為0.00、0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、1.20 及2.40 mg/L（藥物用培養(yǎng)基溶解），并分別作為0.00、0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、1.20 及2.40 mg/L 組。同時也把培養(yǎng)時間分為 5 個梯度，分別為0、12、24、48 及72 h。細(xì)胞進(jìn)行 96 孔板鋪板，邊緣孔用無菌PBS 填充，每組設(shè)置6 個重復(fù)孔。隔夜培養(yǎng)后第2 天加入梯度藥物，隨后進(jìn)行梯度時間培養(yǎng)。每組到時間后加入20μl MTT（5 mg/ml）培 養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)后吸去殘液并加入150μl DMSO（37℃震蕩10 min）。最后用酶標(biāo)儀檢測490 nm 波長處的吸光度值，得到的數(shù)值用Prism 7 軟件處理。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

本實(shí)驗(yàn)分為對照組和雷公藤紅素組，對照組為未經(jīng)任何處理的HEYa8 人卵巢癌細(xì)胞，雷公藤紅素組根據(jù)MTT 結(jié)果得到最適處理濃度及時間，應(yīng)用雷公藤紅素處理HEYa8 細(xì)胞。在機(jī)制實(shí)驗(yàn)部分，應(yīng)用PI3K特異性激動劑（IGF-1）后，分為IGF-1（+）雷（+）組（同時加入IGF-1 和雷公藤紅素）、IGF-1（-）雷（+）組（只加入雷公藤紅素）和IGF-1（+）雷（-）組（只加入IGF-1）[10]。

1.5 Transwell 法測定細(xì)胞遷移、細(xì)胞分裂指數(shù)及細(xì)胞計數(shù)

在24 孔板配套的Transwell 小室里接種5×104個/ 孔細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，小室以下孔板用血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h 后，利用0.1%結(jié)晶紫染色小室細(xì)胞，觀察侵襲細(xì)胞的數(shù)量并拍照計數(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，加入秋水仙素0.1μg/ml 后再培養(yǎng)40 min，隨后顯微鏡下觀察1 000 個細(xì)胞中分裂期細(xì)胞（洋蔥狀）數(shù)量，并用百分比表示。細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，用細(xì)胞計數(shù)儀分別測算兩組細(xì)胞的數(shù)量。

1.6 Western blotting 檢測

采用Western blotting 檢測凋亡相關(guān)蛋白（GSDMS-N、Caspase-1、NLRP3、ASC、IL-1β、IL-18）和PI3K/Akt 信號通路關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白（PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt）相對表達(dá)量。用預(yù)冷PBS 洗凈細(xì)胞，再用RIPA+PMSF 裂解細(xì)胞并提取蛋白，之后進(jìn)行制膠電泳及轉(zhuǎn)模。孵育一抗過夜，GSDMS-N（1∶500），NLRP3、ASC、Caspase-1 及IL-18（1∶800），IL-1β、GAPDH、PI3K、Akt、p-PI3K 及p-Akt（1∶1 000），之后用TBST 洗凈，再孵育相應(yīng)二抗2 h，隨后拍照。所得條帶用Image J 軟件分析，用Prism 7 軟件處理數(shù)據(jù)。

1.7 免疫熒光雙標(biāo)檢測

細(xì)胞先用PBS 洗凈，隨后用4%多聚甲醛溶液固定，再用3% Triton 孵育10 min，GSDMS-N（1∶1 000）過夜，第2 天用相應(yīng)熒光二抗孵育后再用CD44（1∶1 000）孵育，用相應(yīng)二抗孵育室溫2 h，孵育10 min 的DAPI（1∶1 000）。最后用PBS 清洗，再用熒光顯微鏡拍照，數(shù)據(jù)用Image J 及Prism 7 軟件分析處理。

1.8 qRT-PCR

采用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，依據(jù)RevertAid RT Reverse Transcription Kit（美國Thermo Fisher 公司）試劑盒說明書將定量1μg 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后qRT-PCR 檢測每組細(xì)胞內(nèi)NLRP3、ASC、IL-1β 及Caspase 1 的表達(dá)量。NLRP3 正向引物： 5'-GATCTTCGCTGCGATCAACAG-3'（21 bp），反向引物： 5'-CGTGCATTATCTGAACCCCAC-3'（21 bp）， IL-1β 正向引物： 5'-CCTTGTGCAAGTGTCTGA AGC-3'（21 bp），反向引物： 5'-CCCAAGTCAAGGGCT TGGAA-3'（21 bp），ASC 正向引物： 5'-GACGGGGCCA ATACCACAC-3'（18 bp），反向引物： 5'-TCTGTAAC AAAAGTCGTGCTTCT-3'（23 bp），Caspase 1 正向引物： 5'-TGGGTGCAGGCACAATAAATG-3'（21 bp），反向引物： 5'-TTGAGGCAAGTTGAGGGTCTT-3'（21 bp），GAPDH 正向引物： 5'-TGTGGGCATC AATGGATTTGG-3'（21 bp），反向引物： 5'-ACACCA TGTATTCCGGGTCAAT-3'（22 bp）。qRT-PCR 反 應(yīng)條件： 95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，37℃退火60 s，72℃延伸120 s，共計40 個循環(huán)。熒光半定量分析過程： 依次加入cDNA、引物及Q-PCR Mix，最后進(jìn)行熒光半定量分析。數(shù)據(jù)采用Prism 7 軟件處理。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)或單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度及培養(yǎng)時間雷公藤紅素對HEYa8細(xì)胞生存率的影響

不同濃度雷公藤紅素作用12、24、36、48 和72 h 的HEYa8 細(xì)胞生存率比較，經(jīng)重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果如下： ①不同時間點(diǎn)的細(xì)胞生存率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=135.130，P=0.000）； ②不同濃度組的細(xì)胞生存率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=74.860，P=0.000）；③不同濃度組的細(xì)胞生存率變化趨勢比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.604，P=0.043）。最終選擇0.4 mg/L 濃度雷公藤紅素處理24 h 來進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)。見表1和圖1。

表1 不同濃度組各時間點(diǎn)細(xì)胞生存率比較 %

圖1 不同濃度組的細(xì)胞生存率變化趨勢 （±s）

2.2 雷公藤紅素對HEYa8 細(xì)胞侵襲性及增殖性的影響

雷公藤紅素組與對照組侵襲細(xì)胞、細(xì)胞分裂指數(shù)及細(xì)胞數(shù)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），雷公藤紅素組侵襲細(xì)胞、細(xì)胞總的數(shù)量較對照組少，而細(xì)胞分裂指數(shù)低于對照組。見表2和圖2、3。

2.3 雷公藤紅素對HEYa8 細(xì)胞凋亡的影響

雷公藤紅素組與對照組凋亡相關(guān)蛋白相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），雷公藤紅素組較對照組高（見表3和圖4～6）。雷公藤紅素組與對照組CD44/GSDMS-N 雙陽性細(xì)胞占總細(xì)胞百分比分別為（38.33±6.0）%和（61.67±4.4）%，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.351，P=0.033），雷公藤紅素組較對照組低。

表2 雷公藤紅素組與對照組侵襲細(xì)胞、細(xì)胞分裂指數(shù)及細(xì)胞數(shù)量比較 （±s）

表2 雷公藤紅素組與對照組侵襲細(xì)胞、細(xì)胞分裂指數(shù)及細(xì)胞數(shù)量比較 （±s）

組別 侵襲細(xì)胞/個 細(xì)胞分裂指數(shù)/% 細(xì)胞數(shù)量/個雷公藤紅素組 97.70±9.28 27.33±4.48 523.3±233.3對照組 178.30±11.67 52.00±6.65 826.7±328.3 t 值 5.143 3.073 7.534 P 值 0.007 0.037 0.002

圖2 雷公藤紅素組與對照組侵襲細(xì)胞比較

圖3 雷公藤紅素組與對照組細(xì)胞分裂指數(shù)比較

表3 雷公藤紅素組與對照組凋亡相關(guān)蛋白相對表達(dá)量比較 （±s）

表3 雷公藤紅素組與對照組凋亡相關(guān)蛋白相對表達(dá)量比較 （±s）

組別 GSDMS-N Caspase 1 NLRP3 ASC IL-1β IL-18雷公藤紅素組 0.90±0.03 0.94±0.04 0.88±0.04 0.91±0.04 1.03±0.09 0.95±0.07對照組 0.70±0.06 0.72±0.07 0.52±0.04 0.75±0.03 0.82±0.06 0.78±0.07 t 值 3.102 2.9137 3.875 3.302 2.607 2.573 P 值 0.043 0.038 0.021 0.029 0.041 0.030

圖4 雷公藤紅素組與對照組凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.4 雷公藤紅素對PI3K/Akt 信號通路的影響

雷公藤紅素組與對照組PI3K/Akt 信號通路關(guān)鍵分子的蛋白相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），雷公藤紅素組較對照組低。見表4和 圖7、8。

2.5 各組NLRP3、IL-1β、ASC 和Caspase 1 mRNA 及蛋白相對表達(dá)量的變化

各組NLRP3、IL-1β、ASC 和Caspase 1 mRNA相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），IGF-1（+）雷公藤紅素（+）組與IGF-1（-）雷公藤紅素（+）組NLRP3、IL-1β、ASC 和Caspase 1 mRNA 相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。各組凋亡關(guān)鍵因子NLRP3、IL-1β、ASC 和Caspase 1 蛋白相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），IGF-1（+）雷公藤紅素（+）組與IGF-1（-）雷公藤紅素（+）組NLRP3、IL-1β、ASC 和Caspase 1 蛋白相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表5、6 和 圖9～11。

圖5 雷公藤紅素組與對照組凋亡蛋白相對表達(dá)量比較 （±s）

圖6 雷公藤紅素組與對照組免疫熒光雙標(biāo)檢測

表4 雷公藤紅素組與對照組PI3K/Akt 信號通路關(guān)鍵分子的蛋白相對表達(dá)量比較 （±s）

表4 雷公藤紅素組與對照組PI3K/Akt 信號通路關(guān)鍵分子的蛋白相對表達(dá)量比較 （±s）

組別 PI3K Akt p-PI3K p-Akt雷公藤紅素組 0.87±0.08 0.57±0.09 0.65±0.09 1.03±0.14對照組 1.46±0.12 1.20±0.15 1.13±0.09 1.57±0.12 t 值 3.914 4.359 3.910 2.828 P 值 0.017 0.012 0.017 0.047

圖7 雷公藤紅素組與對照組PI3K/Akt 信號通路關(guān)鍵分子的蛋白相對表達(dá)量的變化 （±s）

圖8 雷公藤紅素組與對照組PI3K/Akt 信號通路關(guān)鍵分子蛋白的表達(dá)

表5 各組NLRP3、IL-1β、ASC 和Caspase 1 mRNA相對表達(dá)量比較 （±s）

表5 各組NLRP3、IL-1β、ASC 和Caspase 1 mRNA相對表達(dá)量比較 （±s）

組別 NLRP3 mRNA IL-1β mRNA ASC mRNA Caspase1 mRNA IGF-1（+）雷（+）組 1.12±0.04 1.12±0.07 1.25±0.19 1.38±0.08 IGF-1（-）雷（+）組 1.60±0.20 1.21±0.08 1.60±0.15 1.80±0.21 IGF-1（+）雷（-）組 0.85±0.03 0.97±0.07 1.00±0.16 0.90±0.08 F 值 9.133 4.100 4.197 12.22 P 值 0.006 0.049 0.047 0.002

表6 各組NLRP3、IL-1β、ASC 和Caspase 1 蛋白相對表達(dá)量比較 （±s）

表6 各組NLRP3、IL-1β、ASC 和Caspase 1 蛋白相對表達(dá)量比較 （±s）

組別 NLRP3 蛋白 IL-1β 蛋白 ASC 蛋白 Caspase1 蛋白IGF-1（+）雷（+）組 1.02±0.11 1.14±0.04 1.25±0.19 0.88±0.23 IGF-1（-）雷（+）組 2.10±0.46 1.77±0.26 1.60±0.15 1.60±0.25 IGF-1（+）雷（-）組 0.98±0.14 1.20±0.18 1.23±0.15 0.83±0.08 F 值 11.283 4.672 5.349 7.914 P 值 0.004 0.04 0.038 0.019

圖9 各組蛋白的表達(dá)

圖10 各組NLRP3、IL-1β、ASC 和Caspase 1 mRNA 相對表達(dá)量的變化 （±s）

圖11 各組NLRP3、IL-1β、ASC 和Caspase 1 蛋白相對表達(dá)量的變化 （±s）

3 討論

卵巢癌因其惡性程度高、侵襲性強(qiáng)等特點(diǎn)，并且一般臨床發(fā)現(xiàn)已到中晚期，留給患者的選擇幾乎只有手術(shù)與化療[1-2]。雷公藤紅素是具有多種生物活性的天然產(chǎn)物，來源于傳統(tǒng)中藥雷公藤的根皮，應(yīng)用歷史甚久，毒副作用較弱，目前主要應(yīng)用在抗癌的抑制腫瘤血管新生方面[3]。雖然何冰玉等[6]和張亞南等[7]前期研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素具有良好的抑制卵巢癌生長的作用，然而抗癌的分子機(jī)制還不甚明了。

細(xì)胞凋亡是一種新型程序性細(xì)胞死亡方式[11]。有研究表示，提高腫瘤細(xì)胞凋亡水平可以有效抑制腫瘤生長與增殖，腫瘤細(xì)胞凋亡可能是抑制腫瘤細(xì)胞生長增殖的新方向[12]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，提高卵巢癌細(xì)胞的凋亡水平可有效抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲、生長與分裂，這可能與細(xì)胞凋亡后α-NETA 殺傷活性被激活等因素有關(guān)[13]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，用雷公藤紅素最適合治療濃度作用HEYa8 細(xì)胞，可以降低細(xì)胞侵襲性，減少細(xì)胞分裂指數(shù)并減少總的細(xì)胞數(shù)量，這與前期研究結(jié)果基本吻合，證明了雷公藤紅素確實(shí)有抑制卵巢癌細(xì)胞生長的作用。隨后發(fā)現(xiàn)，在雷公藤紅素作用下細(xì)胞凋亡關(guān)鍵因子Caspase 1 水平升高，這可能與雷公藤紅素誘導(dǎo)HEYa8 細(xì)胞凋亡有關(guān)。因?yàn)榧?xì)胞凋亡是一種依賴于Caspase 1 的細(xì)胞死亡，Caspase 1 在凋亡中扮演重要角色[14]。其中前體Caspase 1 需要通過NLRP3 小體（包括NLRP3 及ASC 等分子）的切割才能轉(zhuǎn)化為具有活性的Caspase 1，并且Caspase 1 的作用主要是在于活化IL-1β 和IL-18，從而激活細(xì)胞自身的炎癥反應(yīng)[15]。然而，IL-1β 和IL-18 等炎癥因子還受到GSDMD 的控制，GSDMD 活化成為GSDMD-N后，可以在細(xì)胞膜上形成孔道，使細(xì)胞內(nèi)炎癥內(nèi)容物外放[16]。炎癥內(nèi)容物外放后可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖被抑制，甚至死亡，這也是很多研究報道的細(xì)胞凋亡與腫瘤被抑制的機(jī)制[12-13]。同樣的，筆者發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素可以較好地提升凋亡相關(guān)蛋白的水平，也提高了GSDMD-N 陽性細(xì)胞的比例，這些都說明雷公藤紅素可以提高腫瘤細(xì)胞凋亡水平。有研究報道，細(xì)胞凋亡的發(fā)生可能與經(jīng)典的PI3K/Akt 信號通路相關(guān)，即抑制此信號通路可以有效提高細(xì)胞凋亡水平[17-19]。筆者發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素在HEYa8 細(xì)胞中可以抑制此信號通路，并且用PI3K 特異性激活劑（IGF-1）激活此通路后，雷公藤紅素的促細(xì)胞凋亡作用消失，這提示雷公藤紅素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能抑制了PI3K/Akt 信號通路。

綜上所述，雷公藤紅素具有較好的HEYa8 細(xì)胞抑制作用，引起此現(xiàn)象是因?yàn)槔坠偌t素激活了腫瘤細(xì)胞的凋亡，這個過程可能與其抑制PI3K/Akt 信號通路高度相關(guān)。然而，本實(shí)驗(yàn)的分子機(jī)制研究依舊有限，缺乏深層次的在體研究等，還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探索。