慢性牙周炎患者外周血單核細胞Notch1 mRNA的表達及與疾病嚴重程度的相關性

付海標，閆俊杰

（1.浙江中醫(yī)藥大學研究生院，浙江 杭州 310053；2.麗水市人民醫(yī)院 口腔科，浙江 麗水 323000）

慢性牙周炎為常見的口腔疾病，可導致牙槽骨、牙骨質、牙周膜和牙齦等牙周組織發(fā)炎，為一種長期感染性疾病。細菌菌斑在牙周的定殖可引起牙周慢性炎癥，導致牙槽骨和結締組織破壞，最終造成牙齒脫落。牙齦卟啉單胞菌、厭氧鏈球菌、中間型小球藻等厭氧菌為常見致病菌。慢性牙周炎的典型表現(xiàn)為免疫炎癥反應。慢性牙周炎患者牙菌斑中的厭氧菌等致病菌可引起宿主發(fā)生免疫反應和炎癥反應，造成牙周組織的破壞；這些免疫炎癥反應釋放的炎癥細胞因子進入外周血，對全身各系統(tǒng)產(chǎn)生一定影響，可導致糖尿病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（以下簡稱冠心病）等疾病。輔助性T 細胞17（helper T cells 17,Th17）在慢性牙周炎的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[1]。Th17 在健康人群外周血中也存在，主要參與維持機體內環(huán)境穩(wěn)定，產(chǎn)生免疫應答，協(xié)助機體清除異物抗原，且不損傷人體自身組織。在牙菌斑的作用下，Th17 等T 細胞水平升高，介導細胞免疫應答為主的多種致炎因子水平升高，參與慢性牙周炎的發(fā)生[2]。白細胞介素-17（Interleukin-17,IL-17）由Th17 細胞產(chǎn)生，具有非常強的致炎作用。在牙周炎時，輔助性T 細胞在牙周組織破壞階段通過誘導Th17 等細胞釋放IL-17 等致炎因子參與炎癥反應過程[3]。IL-17 作為一種強大的致炎因子，參與牙周組織的炎癥反應過程，且隨著炎癥程度的加重，IL-17 水平升高，IL-17 水平在一定程度上可反映慢性牙周炎的嚴重程度[4]。有研究發(fā)現(xiàn)慢性牙周炎患者齦溝液和血漿中輔助性T 細胞及其細胞因子IL-17 水平升高，認為Th17 在牙周炎的發(fā)病過程中可能發(fā)揮促炎作用[5-6]。Th17 細胞的分化受多種信號通路調控，其中Notch 信號通路是調控細胞分化的重要通路[7-8]。有研究發(fā)現(xiàn)Notch 信號通路在Th17 細胞的分化中發(fā)揮重要作用[9]。但Notch 在慢性牙周炎患者外周血中的表達水平及其是否對Th17 細胞分化具有調控作用尚不清楚。本文對慢性牙周炎患者外周血單核細胞Notch1 mRNA 表達與Th17 細胞和疾病嚴重程度的關系進行研究，闡明其在慢性牙周炎中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2017年1月—2018年12月麗水市人民醫(yī)院口腔科收治的慢性牙周炎患者150 例作為觀察組，另取同期本院150 例健康體檢者作為對照組。觀察組根據(jù)病情嚴重程度[10]分為輕度組54 例，中度組51 例， 重度組45 例。觀察組男性77 例，女性73 例；年齡24 ～53 歲，平均（43.25±7.34）歲；體重指數(shù)（2.42±0.23）kg/m2。對照組男性75 例，女性75 例；年齡25 ～54 歲，平均（44.12±7.18）歲；體重指數(shù)（2.37±0.21）kg/m2。兩組年齡、性別、體重指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

納入標準：年齡20 ～60 歲，臨床數(shù)據(jù)和資料完整，簽署知情同意書，依從性好，接受正規(guī)治療。

排除標準： 吸煙；妊娠期或哺乳期女性；糖尿病、高血壓、類風濕關節(jié)炎等其他疾病；侵襲性牙周炎；急慢性感染性疾病；免疫系統(tǒng)疾病；影響Notch1 水平的其他口腔疾病；接觸放射線；服用抗菌藥物、激素類藥物、免疫制劑。

1.2 方法

1.2.1 慢性牙周炎患者治療方法采用牙周基礎治療，包括口腔衛(wèi)生指導、口腔潔治、齦下刮治，治療后6 周復查。

1.2.2 標本采集采集慢性牙周炎患者治療前后外周靜脈血，以及健康體檢者體檢當天外周靜 脈血。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）測定外周血Notch1 mRNA采用Ficoll 密度分離法分離兩組患者外周血單個核細胞，參照Trizol 試劑盒說明書提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，進行qRT-PCR。反應條件： 94℃預變性60 s，94℃變性10 s、56℃退火10 s、72℃延伸30 s，共40 個循環(huán)。以2-ΔΔct法計算Notch1 mRNA。Notch1正向引物： 5'-GTCAACGCCGTAGATGACC-3'，反向引物： 5'-TTGTTAGCCCCGTTCTTCAG-3'， 長 度101 bp。qRT-PCR 試劑購自日本TaKaRa 公司。

1.2.4 外周血Th17 細胞、IL-17 水平測定采用流式細胞儀測定外周血Th17 細胞水平，采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）測定外周血IL-17 水平。ELISA 試劑盒購自美國Sigma 公司。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或配對t檢驗；相關性分析用Pearson 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組外周血Notch1 mRNA 表達及Th17 細胞、IL-17 水平比較

兩組外周血Notch1 mRNA表達及Th17細胞、IL-17水平比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），觀察組高于對照組（見表1）。Notch1 mRNA 擴增曲線和熔解曲線見圖1、2。兩組外周血Th17 細胞流式細胞圖見圖3。

表1 兩組外周血Notch1 mRNA 表達及Th17 細胞、IL-17 水平比較 （n =150，±s）

表1 兩組外周血Notch1 mRNA 表達及Th17 細胞、IL-17 水平比較 （n =150，±s）

組別 Notch1 mRNA Th17 細胞/% IL-17/（pg/ml）對照組 1.00±0.06 0.51±0.11 0.61±0.13觀察組 1.56±0.08 1.14±0.15 0.75±0.12 t 值 68.586 41.481 9.692 P 值 0.000 0.000 0.000

圖1 Notch1 mRNA 擴增曲線

圖2 Notch1 mRNA 熔解曲線

圖3 兩組外周血Th17 細胞的流式細胞圖

2.2 不同嚴重程度慢性牙周炎患者外周血Notch1 mRNA 表達及Th17 細胞、IL-17 水平比較

不同嚴重程度慢性牙周炎患者外周血Notch1 mRNA 表達及Th17 細胞、IL-17 水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；中度組和重度組高于輕度組（P＜0.05），重度組高于中度組（P＜0.05）。見表2。

表2 不同嚴重程度慢性牙周炎患者外周血Notch1 mRNA表達及Th17 細胞、IL-17 水平比較 （±s）

表2 不同嚴重程度慢性牙周炎患者外周血Notch1 mRNA表達及Th17 細胞、IL-17 水平比較 （±s）

注： ①與輕度組比較，P ＜0.05；②與中度組比較，P ＜0.05。

組別 n Notch1 mRNA Th17 細胞/% IL-17/（pg/ml）輕度組 54 1.27±0.07 0.87±0.14 0.68±0.11中度組 51 1.53±0.08① 1.11±0.15① 0.77±0.12①重度組 45 1.72±0.09①② 1.24±0.16①② 0.87±0.10①②F 值 398.394 78.944 36.174 P 值 0.000 0.000 0.000

2.3 治療前后外周血Notch1 mRNA 表達及Th17細胞、IL-17 水平比較

慢性牙周炎患者治療前后外周血Notch1 mRNA 表達及Th17 細胞、IL-17 水平比較，經(jīng)配對t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），治療后低于治療前。見表3。

表3 治療前后外周血Notch1 mRNA 表達及Th17 細胞、IL-17 水平比較 （n =150，±s）

表3 治療前后外周血Notch1 mRNA 表達及Th17 細胞、IL-17 水平比較 （n =150，±s）

時間 Notch1 mRNA Th17 細胞/% IL-17/（pg/ml）治療前 1.56±0.08 1.14±0.15 0.75±0.12治療后 1.12±0.09 0.63±0.13 0.64±0.11 t 值 58.876 93.081 67.361 P 值 0.000 0.000 0.000

2.4 慢性牙周炎患者治療前外周血Notch1 mRNA表達與Th17 細胞、IL-17 水平的相關性

慢性牙周炎患者治療前外周血Notch1 mRNA 表達與Th17 細胞、IL-17 水平呈正相關（P＜0.05）。見表4。

表4 慢性牙周炎患者治療前外周血Notch1 mRNA 表達與Th17 細胞、IL-17 水平的相關性

3 討論

慢性牙周炎是牙周組織破壞的主要原因，為牙周軟組織的炎癥狀態(tài)及對牙齒菌斑的直接免疫反應[11]。慢性牙周炎為難治性疾病，是導致成人牙齒缺失的主要原因。慢性牙周炎也增加冠心病、低出生體重兒等的發(fā)生風險，對人類健康造成危害。隨著免疫學的發(fā)展，大量研究證實慢性牙周炎是一種由T 細胞介導的、細胞免疫應答為主的、多種致炎因子共同參與的慢性炎癥性疾病[2]。

本研究結果表明，慢性牙周炎患者外周血Notch1 mRNA 表達及Th17 細胞、IL-17 水平升高，外周血Notch1 mRNA 表達與Th17 細胞、IL-17 水平呈正相關。Notch 家族為一種十分保守的跨膜蛋白，在脊椎動物和無脊椎動物中廣泛存在[12]，在胚胎形成、免疫細胞分化及功能調節(jié)、細胞增殖和凋亡方面發(fā)揮重要作 用[13-14]。Notch 家族可通過Notch1 在Th17 細胞分化中發(fā)揮調節(jié)作用，在類風濕關節(jié)炎、過敏性哮喘等常見自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[15-16]，如呼吸道合胞病毒通過激活Notch1 促進氣道微環(huán)境中Th17 細胞的分化[17]；Notch1 信號可促進銀屑病患者外周血Th17細胞分化[18]。張黎等[19]通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，Notch1信號通路在慢性牙周炎大鼠的免疫平衡調控中發(fā)揮重要作用。結合本研究結果及既往研究分析，Notch1 mRNA 可能通過促進Th17 細胞分化誘導免疫炎癥反應，參與慢性牙周炎的發(fā)病過程。

本研究中隨著慢性牙周炎嚴重程度增加，外周血Notch1 mRNA 表達升高，治療后隨著牙周炎的控制，外周血Notch1 mRNA 表達降低，表明其在一定程度上可反映慢性牙周炎的病情嚴重程度，病情越嚴重，免疫炎癥反應越顯著，Notch1 mRNA 表達越高，通過調控Th17 細胞分化，導致IL-17 等促炎細胞因子水平升高，進一步加重病情發(fā)展。

Notch1 mRNA 可促進Th17 細胞分化，但其機制尚不清楚，探討Notch1 mRNA 促進Th17 細胞分化的機制將是下一步需要研究的內容。