小龍蝦(Procambarus clarkii)加工前后優(yōu)勢腐敗菌的分離與鑒定

鄧 靈,趙 康,夏 開,圣莎麗,解華東,畢旺來,*

(1.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院,湖北武漢 430023;2.重慶市畜牧科學(xué)院,重慶 400039)

小龍蝦學(xué)名克氏原螯蝦(Procambarusclarkii),是淡水螯蝦的一種。小龍蝦是高蛋白、低脂肪、低膽固醇的高營養(yǎng)水產(chǎn)品,蛋白質(zhì)含量17.7%,脂肪含量0.1%,必需氨基酸種類齊全,富含多種不飽和脂肪酸,微量元素比例合理,對人體健康具有極大好處[1]。小龍蝦熟制后肉質(zhì)細(xì)嫩、口味獨(dú)特,備受消費(fèi)者青睞。然而由于蝦類含有較高的蛋白質(zhì)、水分及高活性多酚氧化酶,在捕撈、運(yùn)輸、加工及貯藏過程中,蝦體易受微生物的污染,微生物快速繁殖極易引發(fā)蝦肉腐敗變質(zhì)[2-3]。微生物繁殖的同時(shí)分解營養(yǎng)物質(zhì),生成胺、硫化物、醇、醛、酮和有機(jī)酸等具有不良風(fēng)味的代謝產(chǎn)物[4]。在食品生產(chǎn)過程中,由于原料來源、加工、殺菌、流通和儲藏方法等存在較大的差異,造成了不同蝦產(chǎn)品有著不同的菌相組成,優(yōu)勢腐敗菌可能也有所不同[5]。

目前國內(nèi)外南美對蝦等腐敗微生物種類及消長動(dòng)態(tài)變化的研究較深入[6-8],但小龍蝦的相關(guān)研究還較少。近年來,有關(guān)小龍蝦優(yōu)勢腐敗菌的研究開始引起了科研人員的重視。于曉慧等人對常溫保藏的即食小龍蝦優(yōu)勢腐敗菌進(jìn)行了分離鑒定,證實(shí)為檸檬酸桿菌[9]。江楊陽等人采用常規(guī)平板分離和高通量測序相結(jié)合的方法,發(fā)現(xiàn)冷藏小龍蝦的優(yōu)勢腐敗菌有希瓦氏菌、肉食桿菌、環(huán)絲菌屬、嗜冷菌屬、漫游球菌屬、不動(dòng)桿菌屬、氣單胞菌、束毛球菌屬等[10]。周濤等人鑒別了不同溫度儲存條件下即食小龍蝦的微生物種群多樣性。他們發(fā)現(xiàn)隨著貯藏時(shí)間的延長,小龍蝦微生物多樣性逐漸降低。4 ℃貯藏末期,優(yōu)勢菌群為海洋桿菌屬和希瓦氏菌屬;25 ℃貯藏末期,優(yōu)勢菌群為哈撒韋氏菌屬、芽孢桿菌屬和狹義梭菌屬[11]。張永進(jìn)等利用16S rDNA測序技術(shù),鑒定出巴氏殺菌的即食小龍蝦腐敗菌為蘇云金芽孢桿菌和希瓦氏菌[12]。

近年來,我國小龍蝦產(chǎn)業(yè)飛速發(fā)展,消費(fèi)者對小龍蝦即食產(chǎn)品的需求量越來越大,但即食小龍蝦普遍存在微生物繁殖過快、貨架期短的問題,造成小龍蝦即食產(chǎn)品生產(chǎn)成本高,風(fēng)味成分流失快,食品安全風(fēng)險(xiǎn)大。優(yōu)勢腐敗菌是導(dǎo)致蝦產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的主要因素[13]。本文采用傳統(tǒng)平板分離純化和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法,鑒別生鮮原料小龍蝦和鹵制即食小龍蝦優(yōu)勢腐敗菌,為企業(yè)后續(xù)研發(fā)適宜的殺菌和防腐保鮮工藝提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

原料小龍蝦和即食小龍蝦 原料小龍蝦為活蝦,即食小龍蝦為鎖鮮裝,均由湖北省內(nèi)某企業(yè)提供;其中即食小龍蝦已在15 ℃冷鏈條件下儲存3 d;PCA、MRS培養(yǎng)基 青島海博生物科技有限公司;限制性內(nèi)切酶(MspⅠ)、細(xì)菌核酸提取試劑盒、PCR純化試劑盒 寶生物工程(大連)有限公司;引物合成 上海生工生物有限公司。

水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠;DYY-10C電泳儀 北京六一儀器廠;恒溫培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;梯度PCR儀 德國Biometra公司;臺式高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司;GBox-HR-E-M凝膠圖像系統(tǒng) 英國Syngene公司。

1.2 平板菌落計(jì)數(shù)和細(xì)菌分離純化

挑選鮮活原料小龍蝦和即食小龍蝦,無菌操作,將小龍蝦去頭去殼。稱取蝦肉(帶蝦線)10 g,剪碎后置于無菌均質(zhì)袋,再加入90 mL 0.9%無菌生理鹽水,拍打2 min(速度為7次/s)以獲得10倍稀釋的蝦勻漿。然后將蝦勻漿用無菌生理鹽水按十倍進(jìn)行梯度稀釋。每個(gè)梯度取100 μL稀釋液分別涂布PCA和MRS平板,37 ℃恒溫培養(yǎng),培養(yǎng)48 h后,按照國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)[14]。同時(shí)挑取平板上形態(tài)不同的典型單菌落,進(jìn)行革蘭氏染色,油鏡(100×)觀察細(xì)胞形態(tài)。根據(jù)菌落形態(tài)觀察和革蘭氏染色結(jié)果,進(jìn)行菌株初步分類。將分類不同的代表菌株劃線分離(重復(fù)3次劃線純化),直至獲得純培養(yǎng)物,斜面保存。

1.3 細(xì)菌基因組DNA提取

將純化后的菌株用LB培養(yǎng)基37 ℃過夜振蕩培養(yǎng),采用TaKaRa MiniBEST細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測細(xì)菌DNA的提取質(zhì)量。

1.4 16S rDNA序列擴(kuò)增

采用16S通用引物27F:5′-AGAGTTTGATC MTGGCTCAG-3′,1525R:5′-AAGGAGGTGWTCC ARCC-3′,對提取的細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系為:10×buffer 2.5 μL,2.5 mmol/L dNTP 2 μL,10 μmmol/L上下游引物各1.0 μL,模板1.0 μL,TaqDNA聚合酶0.15 μL,ddH2O 18.35 μL。PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 45 s,60 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s,循環(huán)擴(kuò)增25次;72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5 限制性內(nèi)切酶消化分析

PCR產(chǎn)物用PCR純化試劑盒純化后,用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測純化效果。取10 μL純化后的PCR產(chǎn)物,加入限制性內(nèi)切酶Msp Ⅰ 1 μL,10×T Buffer 2 μL,0.1% BSA 2 μL,ddH2O 5 μL。37 ℃酶切2 h,再加入2 μL 10×Loading Buffer終止反應(yīng)。用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢查酶切后的DNA片段。按照酶切電泳譜型將對應(yīng)菌株進(jìn)行歸類。

1.6 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

選取代表菌株,即將革蘭氏染色結(jié)果、菌落外形、酶切電泳譜型相同的分成同類型,每種類型隨機(jī)挑選菌株進(jìn)行16S rDNA PCR,將PCR產(chǎn)物純化后送至上海生工生物有限公司進(jìn)行雙向測序。將拼接后的16S rDNA輸入NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對,并用MEGA 5.0軟件使用鄰接法(Neighbor Joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,對未知菌種定屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 平板菌落計(jì)數(shù)和優(yōu)勢腐敗菌分離

原料小龍蝦肉和即食小龍蝦肉經(jīng)過勻漿、梯度稀釋涂布平板后,37 ℃培養(yǎng)48 h,進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。PCA平板上活菌平板菌落計(jì)數(shù)原料小龍蝦為2.52×104CFU/g,即食小龍蝦為2.25×104CFU/g。因即食小龍蝦已經(jīng)冷鏈儲存3 d,開始腐敗,所以微生物繁殖數(shù)目較高。MRS平板上鮮有活菌生長,表明原料小龍蝦和即食小龍蝦優(yōu)勢腐敗菌中乳酸菌很少見。觀察平板上的所有單菌落外形顏色,挑選典型菌落接種PCA平板保存,同時(shí)對典型菌株進(jìn)行革蘭氏染色和鏡檢觀察,按革蘭氏染色和鏡檢結(jié)果將菌株進(jìn)行初步分類。即將革蘭氏染色結(jié)果和菌落外形不同的分成不同種類。原料小龍蝦平板分離得到5類細(xì)菌,形態(tài)以桿菌居多,染色結(jié)果有革蘭氏陽性菌也有革蘭氏陰性菌,也有少量革蘭氏陰性球菌。即食小龍蝦平板分離得到1類細(xì)菌,均為革蘭氏陽性桿菌。圖1所示為其中2株典型菌株的革蘭氏染色和鏡檢觀察結(jié)果，1A為來源于原料小龍蝦中的革蘭氏染色紅色桿菌，1B為來源于即食小龍蝦中的革蘭氏染色紫色桿菌。

圖1 革蘭氏染色鏡檢結(jié)果Fig.1 Gram staining photomicrographs

2.2 16S rDNA PCR擴(kuò)增

從原料小龍蝦樣本中分離出來的5類細(xì)菌中挑選并純化了29株菌株,即食小龍蝦樣本中分離出來的1類細(xì)菌中分離純化了10株菌株。將這些菌株過夜培養(yǎng),采用商業(yè)試劑盒提取DNA。1%瓊脂糖凝膠檢測DNA提取質(zhì)量。從原料小龍蝦和即食小龍蝦分離的細(xì)菌基因組DNA均呈現(xiàn)明亮單一的條帶，DNA片段大小約為12000 bp，說明核酸提取完好。圖2列舉了原料小龍蝦分離的部分細(xì)菌DNA電泳結(jié)果。采用細(xì)菌通用引物(27F與1525R)對原料小龍蝦和即食小龍蝦分離的細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增，1.5%瓊脂糖凝膠檢測，PCR產(chǎn)物大小約為1500 bp，和預(yù)期PCR產(chǎn)物大小一致。圖3列舉了原料小龍蝦分離的部分細(xì)菌PCR檢測結(jié)果。

圖2 原料小龍蝦部分細(xì)菌基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of genomic DNA from representative strains isolated from raw crayfish

圖3 原料小龍蝦部分細(xì)菌16S rDNAPCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA PCR products from representative strains isolated from raw crayfish

2.3 限制性內(nèi)切酶酶切分析

將PCR產(chǎn)物用商業(yè)試劑盒純化,經(jīng)限制性內(nèi)切酶MspⅠ酶切后,PCR產(chǎn)物呈現(xiàn)不同的帶型。用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切后的電泳條帶。來源于原料小龍蝦的菌株P(guān)CR產(chǎn)物經(jīng)酶切后呈現(xiàn)5種不同帶型。如圖4所示,泳道1、2、3、4和6代表不同酶切帶型,泳道2和5酶切帶型相同。來源于即食小龍蝦的細(xì)菌PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后僅呈現(xiàn)1種帶型(圖5)。因此判斷原料小龍蝦分離的29株細(xì)菌分屬5種優(yōu)勢菌型,而即食小龍蝦來源的10株細(xì)菌同屬一種優(yōu)勢菌型。原料小龍蝦和即食小龍蝦隨機(jī)挑選5株菌株,培養(yǎng)過夜后提取DNA,并做16S rDNA PCR擴(kuò)增,將PCR產(chǎn)物純化后雙向測序。

圖4 原料小龍蝦細(xì)菌PCR產(chǎn)物酶切圖Fig.4 Restriction endonuclease digestion of PCR products from strains isolated from raw crayfish

圖5 即食小龍蝦細(xì)菌PCR產(chǎn)物酶切圖Fig.5 Restriction endonuclease digestion of PCR products from strains isolated from ready-to-eat crayfish

2.4 16S rDNA測序與系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

將代表菌株16S rDNA測序拼接后的序列,輸入NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST序列比對,選取Max ident與測序序列最接近的參比序列,多序列比對后用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,對未知菌種定種屬。原料小龍蝦測序菌株編號為2、3、5、6、19。即食小龍蝦測序菌株編號為P1、P3、P4、P6、M1。原料小龍蝦優(yōu)勢腐敗菌種類為陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)、溶酪巨球菌(Macrococcuscaseolyticus)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophilia)、微小桿菌(Exiguobacteriumindicum)和芽胞桿菌屬(Bacillusspp.)(圖6)。即食小龍蝦優(yōu)勢腐敗菌種類為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)與蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)(圖7)。原料小龍蝦和即食小龍蝦優(yōu)勢腐敗菌以桿菌為主,這一結(jié)果也和細(xì)菌革蘭氏鏡檢結(jié)果吻合。原料小龍蝦腐敗菌菌相與養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境和物流環(huán)境條件有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),在有氧冷藏過程中,水產(chǎn)品腐敗菌多為假單胞菌或者腐敗希瓦氏菌;如果水產(chǎn)品來源于受污染的水中,腐敗菌多為腸桿細(xì)菌[15]。張永進(jìn)等鑒定出巴氏殺菌的即食小龍蝦腐敗菌為蘇云金芽孢桿菌和希瓦氏菌[12]。本文研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)原料小龍蝦中芽孢桿菌為主要優(yōu)勢菌型。經(jīng)過鹵制高溫工藝后,原料小龍蝦中其他類型的腐敗菌被滅活,僅耐熱的芽孢桿菌留存。因此即食小龍蝦中僅能檢測到蠟樣芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。

圖6 原料小龍蝦分離株系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.6 Phylogenic tree of strains isolated from raw crayfish

圖7 即食小龍蝦分離株系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.7 Phylogenic tree of strains isolated from ready-to-eat crayfish

3 討論與結(jié)論

近年來研究水產(chǎn)品腐敗菌種群分布和消長動(dòng)態(tài)的報(bào)道很多。各種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。采用宏基因組方法雖然能得到比較全面的微生物菌相信息,但該方法耗時(shí)費(fèi)力,價(jià)格昂貴,而且高通量測序得到的很多菌群可能屬于不可培養(yǎng)微生物(Uncultivated Microorganisms)[16]。由于水產(chǎn)品養(yǎng)殖水域、品種、儲藏方式不同,各種文獻(xiàn)報(bào)道的蝦類腐敗菌種類差異甚大。雖然水產(chǎn)品中微生物種類繁多,但隨著儲存時(shí)間延長,通常只有一種或幾種優(yōu)勢腐敗菌取得生長優(yōu)勢,抑制其他微生物生長,并最終導(dǎo)致產(chǎn)品腐敗。因此對企業(yè)來說,并不一定需要闡明水產(chǎn)品腐敗菌菌相的全貌,了解導(dǎo)致產(chǎn)品腐敗的優(yōu)勢腐敗菌種類,并針對性采取殺菌措施最為關(guān)鍵。因此,本文采取了傳統(tǒng)平板分離法、限制性內(nèi)切酶消化PCR 產(chǎn)物和16S rDNA測序相結(jié)合的方法,研究原料小龍蝦和即食小龍蝦的優(yōu)勢腐敗菌種類。相較高通量測序,本文采用的方法成本低廉,能在短時(shí)間內(nèi)查明主要優(yōu)勢腐敗菌。

湯純等人運(yùn)用Illumina MiSeq宏基因組測序方法分析新鮮泗洪小龍蝦不同部位的菌群組成[17],發(fā)現(xiàn)小龍蝦3個(gè)部位的初始菌群組成有一定差別,整蝦和蝦表面微生物組成相似,菌群以黃桿菌屬、不動(dòng)細(xì)菌屬、金黃桿菌屬為主;蝦肉的菌群與蝦整體、表面差別較大,主要由氣單胞菌屬、黃桿菌屬、假單胞菌屬和希瓦氏菌屬組成。這說明整蝦和蝦表面微生物來源與環(huán)境等因素關(guān)聯(lián)更大,而蝦肉微生物主要來源于蝦腸道,微生物多樣性更低,也是導(dǎo)致食品安全潛在風(fēng)險(xiǎn)的主要原因。由于蝦肉是可食部位,本文僅以蝦肉作為研究對象,從原料小龍蝦和即食小龍蝦中均檢出芽孢桿菌,結(jié)果表明,即便經(jīng)過高溫蒸煮工藝,即食小龍蝦中的蠟樣芽孢桿菌與蘇云金芽孢桿菌仍難以除滅;蘇云金芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌都是可以產(chǎn)芽孢的耐熱菌,巴氏殺菌方法很難將芽孢殺滅。小龍蝦的肉質(zhì)特點(diǎn)使得冷藏期間芽孢大量繁殖,嚴(yán)重縮短了貨架期,造成商業(yè)損失。此外,從進(jìn)化角度上看,蘇云金芽孢桿菌與蠟樣芽胞桿菌高度同源,DNA序列只有個(gè)別堿基的差異,相似程度非常高,在學(xué)術(shù)界二者曾一度被公認(rèn)為是同一種菌[18]。蠟樣芽胞桿菌可以引起嚴(yán)重的食物中毒[19-20],而對于蘇云金芽孢桿菌,其潛在的食品安全性問題也同樣應(yīng)該引起足夠重視。

國內(nèi)外有利用含殼聚糖、肉桂精油等抗菌劑的膠原蛋白膜保存對蝦的報(bào)道[21-22],小龍蝦防腐保鮮的相關(guān)研究還很滯后。針對小龍蝦優(yōu)勢腐敗菌群特點(diǎn),研發(fā)合理的殺菌工藝和防腐配方,有助于延長小龍蝦產(chǎn)品的保質(zhì)期,推動(dòng)小龍蝦產(chǎn)業(yè)進(jìn)一步發(fā)展壯大。