時間分辨熒光免疫層析定量檢測牦牛肉中喹諾酮類藥物

趙維章,崔乃元,張漢青,賀敏華,張正英,王云平,馬立才,*

(1.青海省動物疫病預防控制中心,青海西寧 810001;2.北京維德維康生物技術有限公司,北京 100095;3.廣西壯族自治區獸藥監察所,廣西南寧 530001)

牦牛是青藏高原特有的家畜品種之一。大多分布于高寒草原牧區,不僅是高寒草原藏民族及其他少數民族聚居區經濟發展的基礎和象征,而且已成為青藏高原地區畜牧業發展的獨立板塊[1]。隨著牦牛養殖規模的擴大,且由于養殖戶基本以牧民為主,知識水平較低、生態養殖觀念較差,為控制牦牛疫病的發生,在養殖過程中就存在著亂用、濫用、長期或超量使用獸藥的現象,嚴重影響了牦牛肉的安全性[2]。

喹諾酮類(Quinolones)藥物是人工合成的廣譜性抗菌類抗生素,該類藥物具有高效、低毒、廣譜的特點,因而被廣泛應用于畜牧、水產等養殖業的疾病防治[3-4]。喹諾酮類藥物的長期使用會導致藥物殘留和細菌耐藥性的產生,從而嚴重危害人類的健康,同時也具有致癌風險。因此,歐盟、美國、日本等國家已將喹諾酮類藥物列為動物源性食品中殘留檢測的重點監控項目;美國FDA在2005年宣布禁止用于治療家禽細菌感染的恩諾沙星的銷售和使用;2015年我國農業部發布了2292號公告,在食品動物中停止使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種獸藥[5]。目前喹諾酮類藥物殘留的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[6-9]、液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)[10-11]、膠體金免疫層析法和酶聯免疫分析法(ELISA)[12-16]、發光免疫分析法[17-18]等。色譜方法一般需要昂貴的儀器,檢測成本高,且操作復雜,不適合在基層檢測工作中使用。膠體金免疫層析法可以用于基層檢測但不能定量,而酶聯免疫法的檢測時間相對較長,且酶在常溫不穩定。

時間分辨熒光免疫分析技術(Time-resolved fluorescence immunochromatography assay,TRFIA)是近幾年來發展起來的一種非同位素免疫分析技術,該技術操作簡便、易自動化,可有效地排除非特異熒光的干擾,在分析靈敏度上有了很大的提高[19]。該技術兼具了膠體金操作簡便和ELISA可定量的優點,廣泛應用于藥物殘留的檢測。時間分辨熒光分析技術在人類臨床診斷[20-21]、獸藥殘留和食品安全檢測[22]等方面都得到了廣泛的應用,但是還沒有牛、羊組織檢測中應用的相關報道。因此,本研究利用銪微球作為抗體標記物建立一種簡單、快速、高靈敏的牦牛肉中喹諾類藥物(環丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、達氟沙星)殘留的熒光定量免疫層析檢測方法,并對其靈敏度、準確性和精密度等指標進行評價,以期提供一種牦牛肉中喹諾酮殘留量的快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

60份牦牛大腿肉 從青海省同仁縣朝陽清真牛羊定點屠宰場購買,這些樣品分別采集自青海牧區飼養的60頭3歲左右的牦牛;甲醇、乙腈、磷酸氫二鉀、鹽酸、氫氧化鈉、吐溫20、乙酸乙酯、正己烷 國藥集團化學試劑有限公司;牛血清蛋白(BSA) 美國Amresco公司;200 nm羧基化銪微球(365/610 nm,λex/λem) 美國Creative Diagnostics公司;硝酸纖維素膜(NC膜) 美國Millipore公司;樣品墊、吸收墊、PVC底板 上海良信科技有限公司;環丙沙星單克隆抗體G10785、羊抗鼠二抗 北京維德維康生物技術有限公司制備;喹諾酮藥物標準品 美國Sigma公司。

天子天平 天津德安特傳感技術有限公司;冷凍離心機 美國Thermo Fisher Scientific;KQ-100E超聲波清洗儀昆山市超聲儀器有限公司;液相色譜-串聯質樸儀 美國 Thermo Fisher Scientific公司;JYL-C090樣品粉碎機 九陽;WH-400檢測卡恒溫孵育器、FQ-S2時間分辨熒光免疫定量分析儀(365/610 nm) 維德維康生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制 儲備液配制:分別準確稱取1.0 mg環丙沙星(純度94.0%)、恩諾沙星(純度95.0%)、諾氟沙星(純度97.2%)、氧氟沙星(純度99.3%)、達氟沙星(純度94.3%)標準品,用甲醇溶解并定容至10 mL,配制成100 mg/L的標準品儲備液,于-20 ℃保存,備用。

復溶液配制:0.1 mol/L的Tris-HCl、0.5% BSA、0.5% Tween 20、5%蔗糖、0.9% NaCl、0.02% Proclin 300,調節pH為8.0。

1.2.2 熒光微球標記環丙沙星單克隆抗體的制備 本研究采用200 nm羧基化時間分辨熒光微球,具體操作步驟如下[23]:在50 μL熒光微球中加入450 μL活化緩沖液(0.05 mol/L MES,pH5.0),超聲5 min;然后,向微球溶液中依次加入EDC和NHS溶液使其終濃度均為1 mmol/L,室溫振蕩反應30 min,15000×g離心10 min,棄去上清液;將沉淀用500 μL偶聯緩沖液(0.04 mol/L PB,pH8.0)復溶,超聲5 min,加入20 μL 2 mg/mL環丙沙星單克隆抗體,室溫水平搖床2 h,15000×g離心5 min;向沉淀中加入500 μL封閉緩沖液(0.01 mol/L PB,2% BSA,pH8.0),4 ℃振蕩反應過夜;將反應液用離心機以15000×g離心5 min,棄上清,再次使用50 μL復溶緩沖液復溶微球,超聲儀超聲3 min,4 ℃避光保存備用。

1.2.3 試紙條的制備

1.2.3.1 NC膜和樣品吸收墊的制備 用劃膜儀將環丙沙星抗原(1.8 μg/mL,1∶6稀釋)和羊抗鼠二抗(17.5 μg/mL,1∶10稀釋)包被于NC膜上作為檢測線(T線,0.9 μL/cm)和質控線(C線,0.9 μL/cm),將制備好的NC膜置于37 ℃烘箱中過夜干燥。將羧基化銪微球標記的環丙沙星單抗噴于釋放墊上,噴量為2.5 μL/cm,置于37 ℃烘箱中干燥2 h[24]。

1.2.3.2 試紙條的組裝 參照圖1所示,將樣品墊、接合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊依次粘PVC底板上,上述結構的連接處重疊的長度約2 mm,以保證樣品在試紙條上層析反應的順利進行。最后,用斬切機切成3.95 mm寬度的試紙條,避光、干燥環境中保存。

圖1 時間分辨熒光免疫快速檢測試劑卡結構示意圖Fig.1 Schematic diagram of fluorescent immunochromatographic strip

1.2.4 樣品前處理 稱取(3±0.05) g均質后的牦牛肌肉組織于50 mL 離心管中;加入5 mL乙酸乙酯,立即充分渦動5 min;然后用離心機(4000×g以上)離心5 min;取3 mL上清液于新的4 mL離心管中;50～60 ℃水浴中,氮氣吹干;再加入2 mL正己烷,充分渦動30 s,最后加入1 mL 10 mmol/L PB(1%BSA,0.5% Tween 20,1%蔗糖),低速渦動30 s;4000×g以上,離心5 min;完全棄去上層正己烷及中間層雜質;取100 μL作為待測液[17];

1.2.5 檢測步驟 取100 μL待測液滴加至喹諾酮類免疫熒光層析裝置(圖1)中的樣本墊上,在40 ℃檢測卡恒溫孵育器中準確反應8 min后,取出并使用熒光免疫定量分析儀檢測。

1.2.6 標準曲線的繪制及其交叉反應率試驗 取喹諾酮類藥物陰性的牦牛肉樣品,向其中添加喹諾酮類藥物標準溶液使其終濃度分別為:0.00、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00和8 μg/kg充分混勻后,按照1.2.4進行樣本提取。然后,按照1.2.5進行檢測。

選擇與環丙沙星具有類似結構的藥物恩諾沙星、達氟沙星、諾氟沙星、氧氟沙星進行測定,通過各種藥物的標準曲線分別得到其IC50,根據公式:

式中:IC50(環丙沙星)為引起50%抑制環丙沙星的濃度,μg/kg;IC50(類似物)為引起50%抑制的環丙沙星類似物的濃度,μg/kg。

1.2.7 最低定量限(LOQ) 選取經 LC-MS/MS 檢測[25]為喹諾酮類藥物的陰性樣本20份,采用時間分辨熒光免疫層析方法進行測定,分別得到20次結果的均值以及標準差,該方法的LOQ值即為20份牦牛陰性樣本測定結果的均值加上10倍標準偏差。

1.2.8 準確度和精密度 向均質后牦牛肉空白樣品中添加梯度濃度的喹諾酮溶液,使其終濃度分別為1、2和4 μg/kg,將每個濃度梯度添加3個平行;然后按照1.2.4和1.2.5分別進行前處理和檢測。最后,對其準確度和精密度進行分析。

1.2.9 方法學比較 取50份牦牛肉樣品,分別采用本文所建立的時間分辨熒光免疫層析定量分析法和GB/T 21312-2007《動物源性食品中14種喹諾酮藥物殘留檢測方法》液相色譜-質譜/質譜法[25]進行檢測,并對兩種方法檢測結果的一致性進行分析。

1.3 數據處理

以添加樣本中喹諾酮類藥物標準品濃度為X軸(每個濃度重復檢測5次,取平均值),檢測線T熒光信號值與質控線C熒光信號值的比值(T/C)為Y軸,用origin 8.0(Origin Lab Corp,Northampton,MA,USA)軟件中的四參數擬合競爭標準曲線。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制及相關參數

根據所建立的環丙沙星時間分辨熒光免疫層析定量檢測牦牛樣本的標準曲線如圖2所示,檢測結果見圖3，喹諾酮類藥物的相關參數及交叉反應率見表1。

表1 喹諾酮類藥物熒光免疫層析相關參數Table 1 Related parameters of fluorescence immunochromatography for quinolones

圖2 TRFIA檢測環丙沙星的標準曲線Fig.2 TRFIA standard curve for the detection of ciprofloxacin

圖3 不同添加濃度對應的實物圖Fig.3 Physical map corresponding to different added concentrations注:從左到右的檢測卡對應牦牛肉樣品中環丙沙星的添加濃度分別為0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00和8.00 μg/kg。

由表1可知,標準曲線回歸方程的決定系數R2>0.99,說明線性方程好,其IC50較小,說明試劑盒靈敏度較好。環丙沙星抗體與恩諾沙星、達氟沙星、諾氟沙星、氧氟沙星的交叉反應率分別為77.36%、107.66%、93.55%和50.92%,說明該抗體能夠用于檢測恩諾沙星、達氟沙星、諾氟沙星、氧氟沙星幾種喹諾酮藥物。

2.2 定量限

利用所建立的喹諾酮時間分辨熒光免疫層析方法檢測牦牛真實樣本測試數據如表2所示,每個批次根據20個樣本的所測平均值和標準差計算得到該方法對牦牛樣本中喹諾酮類藥物的定量限分別為:0.500(環丙沙星)、0.420(達氟沙星)、0.520(諾氟沙星)、0.620(恩諾沙星)和0.960 μg/kg(氧氟沙星)。

表2 時間分辨熒光免疫層析法定量限(μg/kg)Table 2 Limit of quantitation for time-resolved fluorescence immunochromatography(μg/kg)

2.3 與儀器方法對比

本文以環丙沙星為例,應用本研究所建立的TRFIA方法來檢測牦牛肉中環丙沙星藥物(添加濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0 μg/kg),并且同LC-MS/MS方法進行確認比較,其試驗結果如圖4所示。上述兩種方法檢測結果的線性方程為:Y=0.955x+0.039,決定系數R2=0.978。由此可知,兩種方法對環丙沙星藥物檢測結果一致性較高。

圖4 喹諾酮類藥物時間分辨熒光免疫層析與HPLC-MS/MS結果對比Fig.4 Comparison of TRFIA with HPLC-MS/MS results for quinolones

3 討論

喹諾酮類藥物是繼磺胺藥之后迅速發展起來的一類十分重要的人工合成抗菌藥物,被廣泛用于動物的多種感染性疾病的預防和治療。隨著喹諾酮類藥物的廣泛使用,其不良反應的報道也日益增多。主要表現為動物食欲減退、腹瀉[26]、甚至還會造成肝損害、引發周圍神經病變時間加快等[27]。為了更加高效的對牦牛肉中喹諾酮類藥物進行檢測,本文建立了時間分辨熒光免疫層析方法。

趙莉莉[28]采用時間分辨熒光免疫層析法,建立了恩諾沙星的檢測方法。該方法采用稀土離子Eu3+標記技術建立恩諾沙星時間分辨免疫檢測法并對其進行方法學的考核,檢測其靈敏度為5 ng/L。謝世紅等[29]建立了用于快速檢測喹諾酮類藥物殘留含量的膠體金免疫層析檢測方法,檢測出水產品中,環丙沙星的檢測限為2 μg/kg,可同時檢測15種喹諾酮類藥物。孫曉崢等[30]利用膠體金免疫層析技術檢測肉雞組織中氟喹諾酮的殘留量。結果表明,達氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星等藥物的檢測限為3.2 ng/mL。本研究建立的時間分辨熒光免疫層析方法的定量限為0.42～1.10 μg/kg,顯著低于其他熒光免疫層析方法的定量限。

鄭百芹等[31]利用酶聯免疫技術研制了一種快速檢測魚肉中的喹諾酮類藥物試劑盒,經過試驗測試,該試劑盒對魚肉樣本中氧氟沙星、環丙沙星、氨氟沙星等3種喹諾酮類藥物的檢測限為1.0 μg/kg。李新朋等[32]采用間接競爭酶聯免疫檢測方法檢測氟喹諾酮類藥物在雞肉中的殘留量,其試驗結果檢測出10種氟喹諾酮類藥物的檢測限為0.09～0.64 ng/mL,回收率為85.1%～95.7%。周月華等[33]應用酶聯免疫試驗法,檢測出41份肉雞樣品中喹諾酮類藥物的殘留量在14.5～60 ng/mL。與ELISA方法相比,時間分辨熒光免疫層析方法的操作更簡單,檢測時間只需要8～10 min,可以減少試驗誤差,結果更為準確。

龍啟萍等[2]使用超高效液相色譜-串聯質譜方法檢測牦牛肉中11種喹諾酮藥物的殘留量,結果表明該方法測定牦牛肉的定量下限為1.5 μg/kg,平均回收率為84.2%～97.7%。上述儀器方法與本研究建立的時間分辨熒光免疫層析的靈敏度基本一致,但儀器方法的檢測成本高,檢測時間長且操作困難,不適合大批量的樣品檢測,而時間分辨熒光免疫層析方法操作簡單易學,檢測成本低。

4 結論

本研究建立了時間分辨熒光免疫層析方法,通過對牦牛肉樣品中添加喹諾酮藥物分析其最低檢測限、準確度和精密度等指標。本方法對牦牛肉中喹諾酮藥物的定量限低于0.96 μg/kg,批內添加回收率為82.94%～111.27%,變異系數為4.13%～9.90%,批間回收率為88.86%～107.05%,變異系數為3.86%～9.39%。與環丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、達氟沙星的交叉反應率分別為100%、77.36%、107.66%、93.55%和50.92%。由此說明,本研究建立的牦牛肉中喹諾酮藥物殘留檢測方法的準確度、精密度、靈敏度均較高,操作簡便,可用于牦牛肉中喹諾酮類藥物的實際檢測。