超高壓處理對黑果枸杞汁貯藏及品質特性的影響

蒲 瑩,高慶超,孫培利,王樹林,2,*

(1.青海大學農牧學院,青海西寧 810016;2.青海大學省部共建三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室,青海西寧 810016)

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr)是我國西北荒漠地區獨有的一種藥食兩用的多棘刺灌木植物,屬茄科,主要分布在中國陜西北部、寧夏、甘肅、青海、新疆和西藏;中亞、高加索和歐洲亦有分布。黑果枸杞耐干旱,生于鹽堿荒地、沙地等[1]。黑果枸杞含有豐富營養活性物質,如蛋白質、枸杞多糖、氨基酸、維生素、礦物質、微量元素等,有研究表明,黑果枸杞具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗病毒、降血壓、降血糖和保肝等藥理活性,在食品、醫藥、衛生和化妝品等領域具有廣泛的應用價值[2]。目前,對于黑果枸杞的加工多采用自然干燥直接食用、制作黑果枸杞軟糖、枸杞壓片[3]等產品。黑果枸杞汁具有黑果枸杞原有的色澤和口感,里面大量營養成分沒有被破壞,在很大程度上滿足了消費者對黑果枸杞保健功能的需求,黑果枸杞汁加工技術的改進是實現黑果枸杞產業化生產的重要保障。

已有研究證明加熱處理作用于共價鍵,破壞了果蔬汁中的營養成分,導致不良風味的產生[4]。超高壓技術(Ultra high pressure processing,UHP)是一種在食品行業中極具發展潛力的食品加工方法,能改變生物體高分子中的非共價鍵結構,使蛋白質變性、淀粉糊化、酶失活、微生物菌體破壞而死亡[5],從而延長食品保質期。超高壓卻不會改變共價鍵結構,因此能更好地保持食品的營養和感官特性。UHP是以水或其他液體介質為傳遞壓力的媒介物,處理壓力通常高于100 MPa[6]。常溫或較低溫度條件下,利用高壓使食品中的酶、蛋白質及淀粉等生物大分子改變活性、變性或糊化[7]。

近年來,利用超高壓技術加工果汁的研究也越來越多,如Juarez-Enriquez等[8]利用色澤、總多酚含量、抗氧化能力、抗壞血酸含量、pH、可滴定酸度、總可溶性固形物、多酚氧化酶(PPO)活性、果膠甲基酯酶(PME)活性及感官檢測等評價了超高壓處理金蘋果汁。結果表明處理后的蘋果汁理化性質、營養價值、感官屬性均無顯著變化(P>0.05)。Yu等[9]比較了超高壓均質技術和傳統的巴氏殺菌技術對桑葚汁中各成分的影響。結果表明經過超高壓處理的果汁中,花青素、酚酸(沒食子酸,原兒茶酸,咖啡酸和對香豆酸)和槲皮素糖苷配基含量以及氧化自由基吸收能力降低更多。Aaby等[10]研究了高壓和熱處理對草莓汁貨架期和品質的影響,結果顯示高壓處理對于果汁中花色苷、維生素C含量和色澤和感官指標沒有明顯的影響,表明超高壓加工方式在果蔬汁加工方面的優勢。雖然超高壓技術已經在果汁加工中廣泛應用,但沒有關于超高壓處理黑果枸杞汁的貯藏及品質變化的研究。

本研究針對熱處理黑果枸杞汁易使其營養成分被破壞,抗氧化活性物質花青素被降解等問題,采用超高壓技術對黑果枸杞汁分別進行(300、400、500 MPa)處理10 min,并選用巴氏殺菌75 ℃水浴加熱15 min和不做任何處理的樣品作為對照,對其在貯藏期的品質變化進行動態跟蹤研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑果枸杞 采于青海省諾木洪地區;氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、沒食子酸、氯化鉀 分析純,上海廣諾化學科技有限公司;多酚氧化酶試劑盒、過氧化物酶試劑盒 南京建成生物工程研究所;孟加拉紅培養基、菌落計數培養基、福林酚試劑、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、三吡啶基三嗪(TPTZ) 北京索萊寶科技有限公司。

HHP600/5L型超高壓處理設備 包頭科發高壓科技有限公司;ZD-LZ-0.5螺旋榨汁機 靖江市中德機械制造廠;UV-1780型分光光度計 島津儀器(蘇州)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑果枸杞汁制備工藝 將黑果枸杞摘除果柄、清洗后,進行榨汁,離心沉淀,取上清液備用[11]。將黑果枸杞汁分裝于30 mL耐壓塑料瓶中,用封口膜密封。

1.2.2 黑果枸杞汁處理與貯藏 試驗處理分為超高壓處理和熱處理對照組。

超高壓處理[12]:采用200、300、400、500 MPa壓力下處理10 min。

巴氏殺菌組:黑果枸杞汁在恒溫水浴鍋75 ℃加熱15 min。

空白對照組:將1.2.1得到的黑果枸杞汁不做任何處理,于貯藏條件下貯藏。

貯藏期條件:樣品處理完成后,分別貯藏于4和37 ℃,避光,分別于第0、10、20、30、40 d取樣對相關指標進行測定。

1.2.3 微生物測定 根據《GB 4789.2-2016》相關要求進行菌落總數,酵母菌、霉菌的計數。平板計數培養基和孟加拉紅培養基配制方法參考尹琳琳等[13]方法,并稍作修改。

1.2.4 POD酶、PPO酶活性測定 PPO酶和POD酶活性的測定采用試劑盒法,在420 nm處測定吸光度,計算酶活性。

1.2.5 總酚含量測定 總酚含量測定采用福林酚法[14]。標準曲線用沒食子酸標準品溶液繪制,標準曲線為Y=0.0112x+0.0333,R2=0.9979。

1.2.7 花青素含量測定 花青素含量的測定采用pH示差法[16]。

1.2.8 DPPH自由基清除率 參考丁艷如等[17]方法,取25 μL樣品提取液,加入到4 mL DPPH溶液中,常溫避光1 h,測定吸光值。以不加樣品的DPPH溶液為對照,每100 g樣品清除DPPH自由基的能力以清除同等DPPH自由基的維生素C的克數表示。

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中:A1為樣品和DPPH的吸光度；A2為樣品和甲醇溶液的吸光度;A0為甲醇和DPPH溶液的吸光度。

1.2.9 FRAP亞鐵離子還原能力 參照Yu等[18]的方法。樣品測定取100 μL樣品提取液,加入到4 mL TPTZ工作液(該工作液由0.3 mol/L的醋酸緩沖液、10 mmol/L的TPTZ溶液和2 mmol/L的FeCl3按體積比10∶1∶1配制而成)中,37 ℃反應15 min后,測定其在593 nm處的吸光值。每100 g樣品的FRAP值以還原同等鐵離子的Trolox標準溶液的克數表示。Trolox標準溶液的濃度與吸光值的標準曲線為:Y=0.0039x+0.0011,R2=0.9987。

1.3 數據處理

所有試驗均做3組平行,結果用平均值±標準差表示,利用Excel 2007、SPSS Statistics 20.0等統計軟件進行數據處理和分析。

2 結果與分析

2.1 超高壓處理對黑果枸杞汁貯藏期微生物的影響

由表1可知,超高壓處理壓力不小于300 MPa時菌落總數的對數值均能降低到1.0 lg cfu/mL以下,且在貯藏40 d期間菌落總數沒有增加,這與朱香澔等發現的[19]在200～550 MPa能全部殺滅全部微生物的結果不同,可能是菌群或樣品差異對微生物的抗壓保護作用不同所造成的。同時巴氏殺菌也符合國家食品衛生不大于100 cfu/mL標準的要求,并在貯藏期間沒有發生微生物增加的現象。空白對照在4 ℃條件下貯藏,微生物數量在貯藏期間沒有明顯變化,在37 ℃貯藏條件下,菌落總數在貯藏前30 d沒有出現較大變化,在30 d后呈現減少趨勢,這可能是由于適宜溫度下微生物進行繁殖,果汁樣品內的營養物質被消耗,微生物呈現出從正常生長期到衰亡期的正常變化規律。200 MPa以下的處理壓力均不能有效殺滅微生物,這和徐夏旸等[20]研究的超高壓對白胡蘿卜汁的滅菌的結果一致,后續其它指標測定將不再考慮200 MPa以下的條件。此外,超高壓和巴氏處理的黑果枸杞汁在貯藏期間均未檢出酵母菌、霉菌。

表1 處理前后黑果枸杞汁貯藏期間菌落總數的變化Table 1 Total numbers of colony changes in Lycium ruthenicum Murr juice before and after treatment

2.2 超高壓處理對黑果枸杞汁貯藏期的POD酶和PPO酶活性的影響

由表2～表3可知,超高壓處理壓力大于300 MPa,能有效鈍化POD酶,酶活性顯著低于空白對照(P<0.05),且當壓力大于400 MPa時,POD酶活性降低到了0.5 U/mL以下,這與馬越等[21]研究超高壓處理對番茄中POD酶活性影響一致。在貯藏期間,300 MPa處理的黑果枸杞汁中POD酶活性呈現下降趨勢,400 MPa以上處理POD酶活性沒有發生變化。巴氏殺菌處理也能有效鈍化POD酶,其活性降低到了0.5 U/mL以下,且在貯藏期間沒有發生變化。

表2 處理前后黑果枸杞汁貯藏期間POD酶活性的變化Table 2 Activity of POD enzyme in Lycium ruthenicum Murr juice before and after treatment

表3 處理前后黑果枸杞汁貯藏期間PPO酶活性的變化Table 3 Activity of PPO enzyme in Lycium ruthenicum Murr juice before and after treatment

當處理壓力為300 MPa時,超高壓處理不能有效鈍化PPO酶的活性,與空白對照相比PPO酶活性略有增強,但是差異不顯著,這可能和超高壓處理導致PPO酶中的肽鍵受到壓力作用逐漸形成α-螺旋結構,并且在分子中形成三重螺旋結構,從而縮短了氫鍵的長度,并增強了螺旋的緊密度,所以才會出現有小幅度銨的活性增強現象[22]。在貯藏期間,300 MPa處理的黑果枸杞汁中的PPO酶呈現下降趨勢,400 MPa以上處理PPO酶活性沒有發生變化。

2.3 超高壓處理對黑果枸杞汁貯藏期間活性物質含量的影響

2.3.1 超高壓處理對黑果枸杞汁貯藏期間總酚含量 由表4可知,未處理的黑果枸杞汁中的總酚含量為(87.17±0.03) mg/100 g,不同壓力的超高壓處理對黑果枸杞汁中的總酚含量沒有影響,分別為(87.10±0.13)、(87.11±0.03)、(86.92±0.01) mg/100 g,和空白對照之間沒有顯著性差異(P>0.05)。在不同的貯藏條件下,隨著貯藏時間的增加,總酚含量在逐漸減少。直至貯藏結束,在4和37 ℃貯藏條件下,采用500 MPa處理超高壓處理的黑果枸杞汁總酚含量組減少最多,分別減少了22.87和24.41 mg/100 g,4 ℃條件下貯藏的黑果枸杞汁總酚含量在均大于37 ℃條件下貯藏的果汁。

表4 處理前后黑果枸杞汁貯藏期間總酚含量的變化(mg/100 g)Table 4 Total phenolic content changes in Lycium ruthenicum Murr juice before and after treatment(mg/100 g)

與空白對照相比,巴氏殺菌處理組總酚含量減少了14.59 mg/100 g,并且在4和37 ℃貯藏期間分別減少了27.54和31.13 mg/100 g,減少量大于超高壓處理組。許文文等[23]研究超高壓對草莓果肉飲料貯藏品質的變化發現在貯藏期間草莓果肉飲料中的總酚一直在減少,到貯藏結束下降了34.14%。總酚含量減少可能是殘存的少量多酚氧化酶作用,同時在貯藏過程中兒茶素等酚類物質發生氧化也會導致酚類物質減少,酚類物質減少還和果汁種類、溶解氧、酶等多種因素有關。

2.3.2 超高壓處理對黑果枸杞汁貯藏期總多糖含量的影響 由表5可知,未處理的黑果枸杞汁中的總多糖含量為(61.86±0.71) mg/mL,超高壓處理的不同壓力對黑果枸杞汁中的總多糖含量沒有影響,分別為(61.54±0.19)、(61.04±0.17)、(60.97±0.25) mg/mL,和空白對照之間沒有差異(P>0.05)。在不同的貯藏條件下,隨著貯藏時間的增加,總多糖含量在逐漸減少。直至貯藏結束,在4和37 ℃貯藏條件下超高壓處理總酚含量400 MPa處理組減少最多,分別減少了3.16和8.47 mg/mL,所有處理組總多糖含量在4 ℃貯藏條件下均大于37 ℃條件下貯藏。

表5 處理前后黑果枸杞汁貯藏期間總多糖含量的變化(mg/mL)Table 5 Total polysaccharide content changes in Lycium ruthenicum Murr juice before and after treatment(mg/mL)

巴氏殺菌處理明顯減少了總多糖含量,與空白對照相比,減少了4.62 mg/mL,并且在4和37 ℃貯藏期間分別減少了7.07和10.29 mg/mL,減少量大于超高壓處理組。與超高壓處理比較,巴氏殺菌明顯減少總多糖含量(P<0.05),這可能是由于高溫使黑果枸杞汁中的還原糖發生美拉德反應造成的,總多糖變化趨勢與總酚變化趨勢相似,在20 d左右下降速度增大。高歌[24]研究的超高壓對紅柚汁品質影響發現經超高壓處理后的紅柚汁蔗糖和果糖含量顯著下降,葡萄糖含量未發生顯著性變化,與本研究結果一致。總多糖含量的降低可能與蔗糖轉化酶等多種酶的作用有關。

2.3.3 超高壓處理對黑果枸杞汁貯藏期花青素含量的影響 由表6可知,未處理的黑果枸杞汁中的花青素含量為(2.68±0.08) mg/mL,超高壓處理的不同壓力對黑果枸杞汁中的花青素含量沒有影響,分別為(2.62±0.05)、(2.56±0.01)、(2.58±0.09) mg/mL,和空白對照之間沒有顯著性差異(P>0.05)。在不同的貯藏溫度下,隨著貯藏時間的增加,處理的和未經處理的黑果枸杞汁中的花青素含量在貯藏期間都在緩慢減少,超高壓處理組除了(500 MPa/10 min)外,其余組花青素減少量和空白對照相比差異不明顯,從貯藏30 d開始,在37 ℃條件下貯藏的500 MPa超高壓處理組的花青素含量與空白對照相比出現了顯著性差異(P<0.05),貯藏結束時,花青素含量減少高于其它超高壓處理組,約為1.21 mg/mL。

表6 處理前后黑果枸杞汁貯藏期間花青素含量的變化(mg/mL)Table 6 Total anthocyanin content changes in Lycium ruthenicum Murr juice before and after treatment(mg/mL)

巴氏殺菌降低了花青素含量,與未做任何處理的空白對照相比,巴氏殺菌導致花青素含量減少了0.72 mg/mL,在4 ℃和37 ℃貯藏條件下,直至貯藏結束,分別減少了0.75和0.94 mg/mL,減少量大于超高壓處理組。37 ℃貯藏條件下花青素的損失比4 ℃貯藏損失高,這與花青素結構極不穩定,容易在加熱條件下發生降解有關。

2.4 超高壓處理對黑果枸杞汁貯藏期間抗氧化能力的影響

2.4.1 超高壓處理對黑果枸杞汁貯藏期間DPPH自由基清除率的影響 由表7可知,未處理的黑果枸杞汁對DPPH自由基清除率為88.88%±0.88%,超高壓處理(300、400、500 MPa)對黑果枸杞汁對DPPH自由基清除率分別為86.82%±0.76%、87.40%±0.39%、86.60%±0.38%,和空白對照之間沒有差異(P>0.05),且400 MPa處理對自由基清除率略高于其它處理組。在不同的貯藏溫度下,隨著貯藏時間的增加,樣品對DPPH自由基清除能力在逐漸降低。超高壓處理組在4 ℃條件下開始貯藏直至結束DPPH自由基清除率分別下降了16.90%、17.36%、16.36%,37 ℃條件下貯藏期間下降約19.52%、19.61%、19.70%。從第30 d開始,在37 ℃條件下貯藏的500 MPa超高壓處理組對DPPH自由基清除率與空白對照出現了明顯差異,貯藏結束時,其對DPPH自由基清除能力降低最多,為19.70%。

表7 處理前后黑果枸杞汁貯藏期間DPPH自由基清除能力的變化(%)Table 7 DPPH radical scavenging rate in Lycium ruthenicum Murr juice before and after treatment(%)

巴氏殺菌處理對DPPH自由基清除率影響較大,與空白對照相比,下降了6.71%,4 ℃貯藏期間下降了19.89%,而37 ℃貯藏期間下降了25.32%。

2.4.2 超高壓處理對黑果枸杞汁貯藏期間亞鐵離子還原能力的影響 由表8可知,未處理的黑果枸杞汁中的亞鐵離子還原能力為15.81±0.14 μg/100 mL DW,超高壓處理對黑果枸杞汁中亞鐵離子還原能力沒有影響,分別為15.74±0.04、16.15±0.41、15.95±0.25 μg/100 mL DW,和空白對照之間沒有顯著差異(P>0.05),且400和500 MPa處理對亞鐵離子還原能力略高于其它處理組。在不同的貯藏條件下,隨著貯藏時間的增加,其對亞鐵離子的還原能力在逐漸降低。超高壓處理組在4 ℃貯藏期間對亞鐵離子還原能力下降分別為1.08、1.44、1.33 μg/100 mL DW,37 ℃貯藏期間下降分別為3.24、3.58、3.49 μg/100 mL DW。在整個貯藏期間,不同貯藏條件下的超高壓處理組與空白對照相比,均沒有出現顯著性差異。

表8 處理前后黑果枸杞汁貯藏期間亞鐵離子還原能力的變化(μg/100 mL DW)Table 8 Ferrous ion reduction ability in Lycium ruthenicum Murr juice before and after treatment(μg/100 mL DW)

巴氏殺菌處理對亞鐵離子還原能力影響較大,與空白對照相比,減少了2.11 ug/100 mL DW。4 ℃貯藏期間下降1.6 μg/100 mL DW,而37 ℃貯藏期間下降3.57 μg/100 mL DW。

3 討論

超高壓處理條件對黑果枸杞汁中的酵母、霉菌及菌落總數的殺滅效果不同200 MPa壓力條件下可完全殺滅酵母和霉菌,300、400和500 MPa能使黑果枸杞汁符合國家衛生標準,并且在貯藏期間不會有微生物生長現象發生。超高壓對微生物的滅活效果隨微生物種類不同而不同,在相對較低的壓力條件下就可以殺滅寄生蟲等生理結構相對復雜生物,壓力大于200 MPa就可以完全殺滅酵母菌、霉菌,由于細菌種屬繁多,不同種屬菌種耐壓能力不同,總體而言,革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌更耐高壓,主要是因為革蘭氏陽性菌肽聚糖層的磷壁酸更厚[25]。

果汁中的多酚氧化(PPO)酶和過氧化物(POD)酶是影響果汁品質的重要酶,多酚氧化酶是導致酶促褐變發生的主要酶,其活性的多少直接影響果汁的色澤等品質。過氧化物酶在果蔬體內參與 ACC(1-氨基環丙烷-1-羧酸)轉變成乙烯的作用,并且在酚類物質存在下能降解葉綠素和參與吲哚乙酸的氧化[26]。超高壓處理黑果枸杞汁在300 MPa以上能有效鈍化POD酶,其活性降為未處理的1/2,在300 MPa以上能使POD酶活性降低到0.5 U/mL以下。PPO酶相較POD酶有較強的耐壓性,300 MPa未能顯著降低其活性,400 MPa以上壓力能鈍化其活性,使其降低到0.5 U/mL以下。因為酶是蛋白質結構,多肽鏈形成的α-螺旋、β-轉角、β-折疊及無規卷曲等結構[22],它靠多肽鏈內或肽鏈間的氫鍵穩定其結構,所以超高壓處理對于蛋白的二級結構影響是未知的,這與果汁種類以及酶的特殊蛋白結構有關。

花青素的基本結構為3,5,7-三羥基-2-苯基苯并吡喃,其極不穩定,通常以糖苷化和酰基化的形式存在,易受pH、光照、溫度、金屬離子、酶等因素影響發生降解[27]。不同的花青素結構會導致其結構的穩定性有很大的差異,花青素B環取代基會影響其穩定性,杭園園等[28]研究發現黑果枸杞的花青素類型主要是矮牽牛素,B環取代基主要是羥基和甲氧基,使得黑果枸杞中花青素較自然界中其它甲基化和酰基化的花青素[29]更為不穩定。花青素含量在超高壓500 MPa/10 min處理條件下有所下降,發現樣品在處理過程中,壓力每升高100 MPa,超高壓設備內部溫度會增加5 ℃左右,超高壓處理對花青素含量的影響與處理過程中溫度的升高有一定關系。此外,37 ℃條件下貯藏的黑果枸杞汁中花青素含量顯著降低,這和它的貯藏溫度有極大的關系,Jarkko等[30]研究發現在研究不同果汁花青素在不同溫度下貯藏穩定性時發現,隨著溫度的增加花青素降解半衰期迅速縮減,4和21 ℃的貯藏條件下花青素的半衰期分別是32.5周和6.73周。由此推測37 ℃的貯藏溫度導致花青素半衰期更短。Tiwari等[31]研究發現花青素的減少除了本身性質外,還與多酚氧化酶、過氧化物酶、β-葡萄糖苷酶等酶的活性有關,酶活性越低,花青素損失越少,貯藏期花青素含量的減少可能和高壓處理后未完全鈍化這幾種酶有關。

超高壓處理不會作用于小分子物質,有時高壓處理會使部分活性物質含量升高,鄭欣等[32]對香蕉汁進行500 MPa處理2 min后發現在貯藏8周后總酚含量略微增加,Spanos等[33]發現葡萄汁在25 ℃貯藏9個月期間總酚含量增加是因為聚合多肽酚降解,導致總酚含量增加。

超高壓處理后的黑果枸杞汁未表現出明顯的抗氧化能力降低的情況,于勇等[34]發現用超高壓處理糙米,在100～300 MPa范圍內,抗氧化能力隨著壓力的增大而增大。白潔等[35]研究發現對黑莓汁進行300 MPa超高壓處理15 min,有機酸含量減少,抗氧化能力降低,400、500、600 MPa處理15 min,隨著壓力的增高,其中蘋果酸含量增加抗氧化能力也隨之增強。

4 結論

超高壓處理壓力增大,微生物存活量急劇下降,300 MPa以上壓力處理10 min均能使黑果枸杞汁達到國家衛生標準,且在貯藏過程中沒有發生微生物增殖現象;高壓處理400 MPa能有效鈍化PPO酶和POD酶,減緩了黑果枸杞汁褐變和氧化速率;與巴氏殺菌比較,超高壓處理在極大程度上保證了活性物質的保留率和抗氧化能力。綜合殺菌、鈍酶效果和能耗關系,生產中對黑果枸杞汁處理壓力控制在400 MPa,時間控制10 min為宜。綜上,超高壓對于黑果枸杞汁的處理在有效滅菌鈍酶的同時,在活性物質和抗氧化能力保持方面更是優于常規熱殺菌。低溫貯藏與超高壓技術結合將更有利于黑果枸杞汁進一步加工利用和實現產業化發展。