連翹葉成分及生物活性研究進展

李 敬,尤 穎,,+,趙慶生,周佳欣

(1.河北經貿大學生物科學與工程學院,河北石家莊 050061;2.中國科學院過程工程研究所,北京 100190)

連翹[Forsythiasuspensa(Thunb.)Vahl]為木犀科連翹屬植物,作為中國的傳統中草藥,具有清熱解毒、消腫散結、疏散風熱等多種功效,并且對生存土壤環境沒有特殊要求,在我國山西、河南、河北等地廣泛種植[1]。連翹葉為連翹的葉片,《中華本草》記載“連翹莖葉,性寒,主治心肺積熱”[2]。研究發現,連翹葉中含有連翹苷、連翹酯苷A、連翹脂素等多種化學成分,其中連翹苷、連翹酯苷的含量遠高于常作為藥材原料入藥的連翹果中的含量[3],這些化合物具有較強的抗氧化、抗病毒等生物活性[4]。

研究表明,連翹葉屬于無毒性物質[5-7],這為連翹葉在食品領域開發創造了條件。2017年,山西省頒布了《食品安全地方標準 連翹葉》DBS14/001-2017,在全國首先將連翹葉列入食品范疇,進行管理,規定了連翹葉每日推薦食用量:鮮連翹葉≤15 g/d,干制連翹葉≤6 g/d[8]。在連翹葉開發利用方面,僅有少部分連翹葉制成連翹葉茶食用,大部分連翹葉被丟棄,未得到有效利用,造成資源浪費。本文對連翹葉的功能性成分及其生物活性的研究進行了總結,為連翹葉資源的充分開發利用提供參考。

1 連翹葉成分

連翹葉中成分復雜,除了基本營養成分,還含有連翹苷等多種具備藥用功效的化學成分。

1.1 營養成分

連翹葉經干燥后可制得連翹葉茶,王曉燕等[9]分析了有機連翹葉茶的營養成分。表1將連翹葉茶中營養素含量與其他植物茶進行了比較,可以看出,連翹葉茶中蛋白質的含量略低于沙棘茶,與綠茶及沙棘茶相比,連翹葉茶中的脂肪含量最低,僅為0.31%,表明連翹葉屬于低脂的食品原料。

表1 有機連翹葉茶與其他植物茶中核心營養素含量對比(%)Table 1 Comparison of organic Forsythia suspensa leaves tea with other plant tea in terms of core nutrient contents(%)

1.2 化學成分

連翹葉含有多種化學成分,包括連翹脂苷類、木脂素類、多酚類、有機酸類等。

1.2.1 化學成分的分子結構及含量 目前報道的連翹葉化學成分結構及含量如表2所示。

表2 連翹葉中主要化學成分Table 2 Main chemical constituents of Forsythia suspensa leaves

續表

續表

《中國藥典》2015版規定,藥用的連翹果中連翹苷(C27H34O11)含量不得少于0.15%,連翹脂苷A(C29H36O15)含量不得少于0.25%[20]。從表2中可以看出,盡管處理后的連翹葉的化學成分由于產地等條件不同,含量略有差異,但是其中連翹苷和連翹脂苷A的最低含量分別為2.30%和3.31%,遠高于藥典對于連翹果的含量規定。

1.2.2 主要化學成分的提取方法 連翹葉中含有多種化學成分,但是每種成分的化學、物理特性不一致,因此,針對不同的化學成分需要采用不同的提取方法。

1.2.2.1 連翹苷的提取方法 不同學者采用不同提取方法對連翹葉中的連翹苷進行了提取(表3)。趙詠梅等[21]研究不同提取液中連翹苷的穩定性,結果表明,當pH=7時,連翹苷提取液最穩定。為了提高連翹苷的純度,在提取后常用大孔樹脂柱層析及重結晶等技術進行純化,得到的連翹苷純度>95%[22]。

表3 從連翹葉中提取連翹苷的方法及其得率比較Table 3 Comparison of extraction methods and yield of phillyrin from Forsythia suspensa leaves

1.2.2.2 連翹酯苷A的提取方法 溶劑回流提取法:基于連翹酯苷A能溶于水和乙醇等溶劑,實驗室中常采用溶劑回流提取的方法從連翹葉中提取連翹酯苷A,不同提取溶劑提取出的連翹酯苷A含量不同。梅雪等[12]在從連翹葉中提取連翹酯苷A時,以水、70%乙醇和甲醇分別作為溶劑,提取物中連翹酯苷A含量分別為3.32%、5.36%和8.16%。靖會等[28]對不同濃度乙醇(10%、30%、50%、70%、95%)提取連翹酯苷A的效果進行了比較,50%乙醇作為提取劑時,連翹酯苷A的提取率最高,為96.4%,使用95%乙醇提取時,提取率僅為70.22%。目前實驗室中常采用水、乙醇、甲醇等作為提取連翹酯苷A的溶劑,其中乙醇和甲醇的提取效果較好,但乙醇和水更安全,因此實驗室中常采用50%～60%的乙醇提取連翹酯苷A。

有機溶劑萃取法:有機溶劑萃取法是在溶劑提取出連翹酯苷A的基礎上,繼續加入石油醚、正丁醇等有機溶劑,以達到除去脂溶性色素和水溶性雜質,純化連翹酯苷A的目的。曹克紅等[29]采用有機溶劑萃取與色譜柱精制相結合的方法,成功從連翹葉中提取出純度在95%～99%之間的連翹酯苷A,提取率達到3.5%～5.5%。利用有機溶劑從連翹葉中萃取連翹酯苷A可以降低后期純化連翹酯苷A 的工藝難度,具有節約純化時間的優點,同時提取出的連翹酯苷A純度較高。

離子液體萃取法:離子液體(Ionic Liquid,ILs)是完全由離子組成的低熔點鹽液體,具有波動小、范圍大等優點,已廣泛用于樣品濃縮、分析和分離等過程。目前,離子液體已經被公認為優秀的溶劑分離的生物活性同系物[30-31]。Sun等[32]研究了利用離子液體-基底交聯輔助萃取法(ILUAE)從連翹葉中提取連翹酯苷A和I的方法,該方法可從連翹葉中提取出產量為10.74%的連翹酯苷A,經純化后,連翹酯苷A的純度可達到97.9%。目前國內利用離子液體從連翹葉中提取化學成分的研究較少,可能與離子液體不易回收有關,因此,利用離子液體從連翹葉中提取連翹酯苷A的參考數據較少,有待學者們深入研究。

微波輔助低共熔溶劑提取法:微波輔助低共熔溶劑(Deep Eutectic Solvents,DESs)提取技術是近年來興起的新型提取技術,可應用于從連翹葉中提取連翹酯苷A。周立錦等[33]研究發現,與傳統方法比,微波輔助DESs技術具有更好的破壁效果,連翹酯苷A的提取率也更高,可達到137.62 mg/g。董哲[34]研究微波輔助DESs技術提取連翹酯苷A,發現 DES-B3作為提取溶劑時提取出的連翹酯苷A更穩定。可見,DESs可以代替傳統溶劑從連翹葉中提取連翹酯苷A,在微波輔助技術下,提取效果更好,同時該方法與其他方法相比具有綠色環保的優點。但DESs是混合溶劑,因此在提取時應先對DESs進行篩選,確定從連翹葉中提取連翹酯苷A的最佳溶劑組合,以提高提取率。

浸提與柱層析聯用法:從連翹葉中提取連翹酯苷A時會提取出連翹苷、蘆丁等其他成分,為提取出高純度的連翹酯苷A,學者們常采用浸提與柱層析聯用的方法。楊建雄等[35]發明了乙醇浸提與柱層析聯用的連續提取工藝,在連翹葉乙醇提取液中成功分離得到純度>92%的連翹酯苷A。孫建瑞等[22]在采用53%乙醇溶液水浴浸提方法提取連翹酯苷A的基礎上,用大孔吸附樹脂和反相層析技術對連翹酯苷A進行了純化,純化后的連翹酯苷A的純度>97%。原江鋒等[36]首先使用溶劑提取和柱層析技術制得粗連翹酯苷A,再使用反相硅膠色譜柱層析技術繼續純化,連翹酯苷A純度從62%提高到92%。浸提與柱層析聯用法可以大大提高連翹酯苷A 的純度,但是柱層析的時間較長,提取效率較低,有待進一步優化。

1.2.2.3 連翹脂素的提取方法 連翹脂素在連翹葉中含量較少,不易直接提取。鄧祥敏等[37]采用水提醇沉萃取的方式,在連翹葉中萃取出純度>75%的連翹脂素粗品,繼續進行甲醇結晶,連翹脂素純度>99%。在連翹葉中連翹苷的含量較高,同時連翹脂素是連翹苷的苷元,因此連翹苷可以通過水解的方式轉化成連翹脂素。目前提取連翹脂素的方法多是由連翹苷轉化為連翹脂素,使連翹脂素的含量提高,再進行提取。常用的轉化方法包括酶法和發酵法。樊宏宇等[38]采用酶法將連翹苷轉化為連翹脂素,其工藝流程如圖1所示。

圖1 連翹苷轉化連翹脂素的酶法工藝流程Fig.1 Enzymatic process of conversion from phillyrin into phillygenin

酶法轉化需大量的纖維素酶,成本較高,而微生物發酵法不僅工藝流程簡單,而且節約成本,因此,采用微生物發酵法將連翹苷轉化為連翹脂素受到更多學者的研究和關注。梅建鳳等[39]對連翹苷轉化為連翹脂素的發酵菌種進行了分離和篩選,最終選用的菌株LB使連翹脂素的轉化率高達94.1%。汪青波等[14]通過發酵使連翹葉中的連翹苷大量轉化為連翹脂素,將連翹葉中的連翹脂素含量從1.67 mg/g提高到46.40 mg/g。

1.2.3 化學成分含量的影響因素

1.2.3.1 不同采收時期連翹葉化學成分含量 連翹葉的化學成分含量受采收期的影響。Morimoto等[40]研究表明,連翹干葉中木脂素類(松脂酚、羅漢松樹脂酚、牛蒡子苷元)的苷元和糖苷總含量普遍在6月份時最高,其中牛蒡子苷元的含量>30 mg/g。通過比較不同采收時期連翹葉中化學成分含量顯示,在不同地區,連翹葉中的連翹苷和連翹酯苷A均在4～6月份時含量較高(圖2)[13,18,41]。王雨虹等[42]采用高效液相色譜(HPLC)技術,對太原地區采收期為6～10月的連翹葉中連翹苷等成分的含量進行了測定,結果顯示,連翹葉中連翹苷和連翹酯苷在6月最高,分別為10.35和67.25 mg/g,8～10月份含量不斷下降。朱鳳云[43]等研究了連翹葉在4月到10月期間連翹苷含量的變化情況,發現5月份最高(含量為12.827%),10月份最低(含量為1.520%)。分析原因可能是,在每年4～5月份連翹葉萌發新芽,按照連翹葉的生長周期規律,在4～6月份大多地區連翹葉中的化學成分含量是最高的。

圖2 不同地點(A、B、C)不同月份采收的連翹葉化學成分含量Fig.2 Chemical composition of Forsythia suspensa leaves harvested in different locations(A,B,C)in different months注:A:2011年河北井陘縣洞陽坡;B:2011年河南靈寶朱陽山;C:2016年山西大學校內。

1.2.3.2 不同產地連翹葉化學成分含量 產地也會影響連翹葉中的化學成分含量。原江鋒等[44]采用液質聯用(LC-MS)技術,分析了不同產地連翹葉和連翹花中的活性成分含量,結果表明,不同產地的連翹葉、花的化學成分組成基本一致,但含量有所差別:在16個地區中,山西臨汾和山東泰安的連翹葉的蘆丁含量分別為(2.84±0.06)和(0.47±0.03) mg/g;洛陽龍門和河南盧氏所產連翹葉中連翹苷含量分別為(45.72±0.41)和(12.45±0.12) mg/g;不同產地連翹葉中連翹酯苷A的含量差別最為明顯,陜西西安的連翹葉中連翹酯苷A含量為(53.22±0.43) mg/g,而陜西洛南的連翹葉中連翹酯苷A含量僅為(2.64±0.03) mg/g。楊棣華等[45]測定了不同產地連翹葉中連翹酯苷A和連翹苷的含量,發現二者含量分別在2.96%～5.28%和2.14%～4.01%之間。不同產地中連翹葉化學成分含量具有差異性,可能與產地的水源、氣候和土壤條件等因素有關。

1.2.3.3 不同加工方式下連翹葉化學成分含量 不同加工方式對連翹葉中化學成分的含量影響明顯,表4列出了不同加工方式對連翹葉化學成分含量的影響。李蒙蒙[46]考察了加工方式對連翹葉中連翹脂素等成分含量的影響,結果顯示,在不同烘干條件下,炒制并在80 ℃下烘干的連翹葉中連翹脂素的含量最高(在0.2%以上),其次是蒸制,燙制后的連翹脂素含量最低(小于1%);在燙制法干燥后,連翹酯苷A的含量最高,其次是蒸制和炒制。麻景梅等[47]對不同干燥條件下連翹葉茶中的連翹苷等成分的含量進行了測定,發現在不同干燥條件下,連翹葉茶中黃酮含量較穩定,連翹苷的含量在通風陰干24 h的條件下最高(6.89 mg/g),在100 ℃鼓風干燥的條件下最低(3.09 mg/g)。與曬干相比,烘干后的連翹苷和連翹酯苷A更易保存;蒸、炒后干燥對連翹苷和連翹酯苷A的保存效果更好,可能與蒸、炒的殺酶保苷作用有關[48];煮制陰干時連翹酯苷A含量更高,可能是因為煮制時連翹葉的部分連翹酯苷A溶解在水中,更容易被溶劑提取[49]。在75%乙醇溶解,超聲處理的提取方法下,微波干燥的加工方式使連翹葉中的連翹酯苷含量更高,但成本較高,在應用上會受到限制[50]。綜合考慮,采用蒸后陰干或烘干的加工方式更有利于連翹葉中化學成分的保留,同時成本不會過高,更適合應用于工業化生產。

表4 不同加工方式下連翹葉化學成分含量Table 4 Chemical composition of Forsythia suspensa leaves under different processing methods

2 生物活性

2.1 抗病毒活性

研究表明,連翹苷和連翹酯苷具有較強的抗病毒活性[52-55]。Qu等[52]為了發現新的抗流感藥物,在體內研究了連翹苷對甲型流感病毒感染的抗病毒作用,在感染A型流感病毒的小鼠中,以20 mg/kg/d的劑量連續3 d給藥可顯著延長小鼠的平均生存時間,減輕了肺組織損傷,表明連翹苷對A型流感病毒感染具有潛在的保護作用。玄振玉等[53]也證實了高純度的連翹酯苷具有體外抗流感甲型病毒及退熱作用,可應用于抗病毒藥物。在新型冠狀病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)的預防和治療中,傳統中藥被廣泛采用,特別是在治療癥狀較輕的病例中,其中連花清瘟膠囊在抗擊新冠肺炎中表現出良好療效。鐘南山研究團隊在分析武漢醫院收治的COVID-19患者臨床資料的基礎上,在透射電鏡下觀察蓮花清溫膠囊對新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)粒子形態的影響,結果證實了連花清瘟膠囊可明顯抑制SARS-CoV-2的復制,并在體外發揮抗炎作用[54]。Cheng等[55]采用柔性對接方法,將連花清瘟膠囊中21種化合物和SARS-CoV-2的主要蛋白酶進行對接打分,結果顯示,蘆丁、連翹脂苷E、金絲桃苷的分數均優于洛匹那韋(Lopinavir)。其中,金絲桃苷可能是SARS-CoV-2主要蛋白酶的抑制劑。

盡管上述研究中所用原料都是連翹果,但發揮功效的成分,比如連翹苷、連翹脂苷A、金絲桃苷等,在連翹葉中也大量存在,并且連翹苷和連翹酯苷A的含量在連翹葉中遠高于連翹果,因此從連翹葉中分離的化合物有望成為抗COVID-19的一個新的藥物篩選方向。

2.2 抗菌活性

連翹葉的乙醇提取物具有廣譜抗菌作用。王小敏等[17]測定了連翹葉乙醇提取物對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度,為3.125 mg/mL,與連翹果乙醇提取物的最低抑菌濃度(6.25 mg/mL)相比,連翹葉乙醇提取物的抑菌效果更好。張元波[56]對連翹葉抗菌作用的化學物質基礎進行了研究,發現連翹葉提取物中的連翹酯苷A和連翹酯苷I是抗菌的基礎物質,從連翹葉提取出的連翹酯苷A與頭孢唑林、萬古霉素兩種抑制劑共同使用時,抑菌效果會增強(表5)。

表5 連翹酯苷A與頭孢唑林、萬古霉素共用時的抑菌效果Table 5 Antibacterial effect of sythiaside A combined with cefazolin and vancomycin

2.3 抗氧化活性

科學研究表明,人體衰老是自由基不斷氧化從而引發組織損傷的結果,而自由基的平衡可以通過補充抗氧化劑來調節,因此,從植物材料中提取更安全的天然無毒的抗氧化劑來代替人工合成的抗氧化劑已經引起了學者們的關注。連翹葉中含有連翹酯苷A和酚類等活性成分,具有較強的抗氧化活性。張元波等[57]對連翹葉提取物進行了抗氧化測定,認為酚類是連翹葉抗氧化的物質基礎。Jiao等[41]利用LC-MS/MS技術對連翹葉泡茶液中主要活性成分進行了比較,并測定了其抗氧化活性,結果顯示連翹葉中的主要活性物質在早期(4月)的含量最高,并且抗氧化能力最強。Yuan等[58]采用多種生化方法篩選了粗連翹苷、純化連翹苷、粗連翹酯苷和純化連翹酯苷的抗氧化性能。結果表明,連翹酯苷具有較強的DPPH自由基清除能力、還原力和脂質過氧化作用,其水平優于丁基羥基甲苯(Butylated Hydroxytoluene,BHT),濃度為25～30 μg/mL的純化連翹酯苷的DPPH自由基清除活性>90%,表明連翹葉可作為天然抗氧化劑的經濟膳食來源,改善人體健康。

2.4 保肝功效

研究發現連翹葉茶有保護肝臟的功效。劉靜[59]通過小鼠模型實驗發現連翹葉茶提取物能夠顯著提高肝損傷小鼠血清中總膽紅素(Total Bilirubin,TBIL)和蛋白質(Protein,TP)的含量,表明連翹葉茶可改善肝損傷小鼠膽紅素的代謝和肝臟合成蛋白質的功能。白美美[60]以醉酒小鼠血清中的血漿抗利尿激素(Antidiuretic Hormone,ADH)活性作為檢測指標,測定了連翹葉紅茶、綠茶對小鼠的解酒功效,模型組小鼠的醒酒時間為(494.8±34.1) min,給予連翹葉紅茶及綠茶后,小鼠醒酒時間縮短,其中綠茶高劑量組(18 g/kg)小鼠的醒酒時間僅為(254.7±107.5) min,同時連翹葉茶使酒精中毒小鼠血清的ADH活性升高,表明連翹葉茶可以減輕酒精中毒小鼠的肝臟受損程度。

2.5 降血脂、血糖功效

周菲[18]在實驗中發現,連翹葉粗提物可以抑制的胰脂肪酶(Pancreatic Lipase,PL)活性,既減少了人體對脂肪的吸收,又降低了血脂,其中6月份的連翹葉提取物對PL的抑制率最高,粗提取濃度為1000 μg/mL時抑制率達到46.64%。Kang等[61]從連翹葉中提取出連翹脂素和槲皮素等五種化合物,并對五種化合物的降血脂功效進行了研究,服用蘆丁后,小鼠血清中的總膽固醇含量為3.124 mmol/L,而高膽固醇飲食組的小鼠血清中總膽固醇含量為4.402 mmol/L,表明蘆丁具有較高的降血脂活性,Kang等認為這與蘆丁等化合物的抗氧化機制有關。Xu等[62]從連翹葉中分離得到連翹苷等活性成分,研究了其對脂肪細胞胰島素抵抗機制的影響,結果顯示連翹苷在100和200 μmol/L的濃度下有顯著增加葡萄糖消耗的作用,改善了胰島素的抵抗機制,起到降血糖的作用。

3 展望

連翹作為中藥在中國的使用歷史已經十分悠久,常作為連花清瘟膠囊等中成藥的主要藥物原料,用來治療外感風熱等病癥,這些中成藥針對目前全球流行的新冠肺炎病毒也有一定的抑制作用。連翹葉同連翹果一樣,也含有多種清熱解毒的活性物質,如連翹苷、連翹酯苷A、連翹脂素等活性成分,表明從連翹葉中提取分離化合物有望成為抗COVID-19的一個新的藥物篩選方向。

隨著科學家對連翹資源研究的不斷深入,除了目前學者研究的活性成分外,連翹葉中還有更多未知的活性成分有待發掘,還可以利用新的提取技術,如正滲透、超濾、納濾、膜萃取、超臨界流體萃取等,從連翹葉中提取具有藥理作用的活性成分,針對不同的活性成分分別或聯合進行研究。另外,從連翹葉中提取活性成分的工藝設備仍需要不斷創新,將其應用于實際生產中,以提高目標產物的提取率及純度。

目前國內市場上常見的連翹葉產品只有連翹葉茶,其制備工藝較為成熟,但產品種類較單一,可以將連翹葉與其他食品原料相結合,研發具備減肥、保肝、抗疲勞、降血脂、降血糖、抗菌、抗病毒等功效的一系列功能性食品,比如茶飲品、餅干、面包等,可大大提高連翹葉的經濟附加值和綜合開發程度,對于壯大連翹葉“種植-初加工-深加工-銷售”產業鏈的發展具有重要意義。