亨氏馬尾藻巖藻聚糖的提取及體外吸附膽酸鹽的作用

林沛純,諶素華,鄭素麗

(1.廣東海洋大學化學與環境學院,廣東湛江 524088;2.廣東海洋大學深圳研究院,廣東深圳 518108;3.廣東海洋大學食品科技學院,廣東湛江 524088)

膽酸鹽是指人和動物的膽汁中由膽固醇衍生而來的具有甾核結構的一類兩性大分子,對脂肪和膽固醇的消化吸收和脂溶性維生素的代謝起重要作用[1]。高脂血癥俗稱高血脂,是因為血脂代謝障礙所致脂質水平(總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇)異常,它是各種健康疾病相關的主要危險因素之一,包括肥胖和心血管疾病,高血脂每年在世界上造成400萬人死亡[2]。機體內膽固醇的合成主要在肝臟和腸上皮之后小腸進行吸收,通過膽汁和糞便進行排泄[3]。膽固醇以膽汁酸形式排出體外,膽汁酸可與甘氨酸或?；撬峤Y合形成膽酸鹽。因此減少腸道內的膽酸鹽,對降膽固醇、降血脂有著重要作用。任丹丹[4]研究已證明從植物黃秋葵中提取的多糖具備吸附膽酸鹽的能力,田月月[5]研究證明了大豆多糖也具備吸附膽酸鹽的能力,劉萍等[6]證實芋頭多糖能在體外吸附膽酸鹽。

馬尾藻屬褐藻門、墨角藻目、馬尾藻科、馬尾藻屬[7]。我國的馬尾藻種類繁多,資源豐富,但開發利用程度較低[8]。馬尾藻多糖主要是巖藻聚糖硫酸酯,其單糖組成主要是巖藻糖,并含有活性基團硫酸基,英文名是fucoidan,最早是由Kylin在二十世紀初提出來并命名的[9]。目前研究發現該糖具有抗腫瘤、抗凝血、抗菌、抗氧化、免疫調節等多種生物活性[10-20],具有極大的藥用價值。這些活性主要是與巖藻糖的含量、活性基團硫酸基含量以及所在位置等密切相關。本實驗研究不同組分的亨氏馬尾藻巖藻聚糖體外吸附膽酸鹽的能力,為亨氏馬尾藻巖藻聚糖降膽固醇活性及其機制的研究提供理論基礎,為馬尾藻巖藻聚糖的綜合利用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

亨氏馬尾藻 采自廣東省湛江市硇洲島海域;DEAE-52纖維素 北京鼎國昌盛生物技術有限公司;葡萄糖、巖藻糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖 色譜純,購自上海源葉生物科技有限公司;糠醛、PMP分析純 上海麥克林生物科技有限公司;?；悄懰徕c、甘氨膽酸鈉、膽酸鈉Aladdin Industrial Corporation;其他試劑 均為國產分析純。

V-5000型可見分光光度儀 上海元析儀器有限公司;FD8508型冷凍干燥機 韓國ilShin公司;RE-52A型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料預處理 將新鮮的亨氏馬尾藻進行清洗、曬干、干燥、粉碎,最后過80目篩得到亨氏馬尾藻粉。

1.2.2 亨氏馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯粗多糖的提取 取適量上述馬尾藻粉,按照1∶30的料液比加入蒸餾水,采用超聲波輔助水提法[21]、離心、取上清液于旋轉蒸發儀濃縮,進行二次醇沉除去褐藻膠,將所得沉淀用丙酮和無水乙醇洗滌以除去脂肪,真空冷凍干燥,制得亨氏馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯粗品(HSP0),取2 g HSP0溶于150 mL蒸餾水中,攪拌溶解得多糖液,加入sevage試劑除蛋白質[22],劇烈搖晃,離心取上清液,重復操作至離心時無沉淀產生,透析48 h后,真空冷凍干燥得到粗多糖(HSP1)。

1.2.3 HSP1的分離純化 將DEAE-52纖維素用0.5 mol/L NaOH、0.5 mol/L HCl、0.5 mol/L NaCl溶液進行活化,依次用0、0.5、1.0、1.5 mol/L NaCl溶液對HSP1溶液進行洗脫,依次洗脫出的組分分別命名為F0、F1、F2、F3。根據苯酚硫酸法[23]所檢測得到的吸光度值,繪制洗脫管數與吸光度值的洗脫曲線,收集曲線中同一峰型的樣品。

1.2.4 化學組成測定 采用苯酚硫酸法[23]測定多糖含量;半胱氨酸鹽酸鹽法[24]測定L-巖藻糖含量;明膠比濁法[25]測定硫酸基團含量;間羥基聯苯法[23]測定糖醛酸含量。

1.2.5 單糖組成分析 根據化學組成中多糖、硫酸基和巖藻糖的含量較高,所以選擇HSP0和F2進行單糖組成分析,采用高效液相色譜法進行分析。參考王晶[26]、戴軍[27]、Fu[28]等人的方法,并略作改動。色譜條件:Agilent1100高效液相色譜儀;色譜柱為XDB-C18,柱溫為30 ℃,柱流量為1.0 mL/min,以磷酸二氫鉀緩沖液(0.05 mol/L,pH7.6)/乙腈(83∶17)為流動相,進樣量為10 μL。

1.2.6 膽酸鹽的測定 參照周小理等[29]采用的糠醛比色法,并做一定修改。分別配制質量濃度為2.0 mg/mL的甘氨膽酸鈉、膽酸鈉、?；悄懰徕c溶液。配制一系列不同濃度梯度的膽酸鹽標準溶液,加入40%硫酸和0.3%糠醛進行反應,在620 nm波長處測定吸光度,繪制濃度與吸光值的標準曲線。

1.2.7 亨氏馬尾藻巖藻聚糖體外吸附膽酸鹽能力的測定 參照周小理等[29]采用的糠醛比色法,并做出一定修改。根據課題組前期預實驗和鐘思燕[30]的實驗中不同馬尾藻粗多糖膽酸鹽結合率的實驗結果,選擇一定濃度的組分進行實驗。把多糖樣品加入到配制好的膽酸鹽溶液中進行反應,1.5 h 后進行離心,在620 nm波長處測定吸光度值,根據下面公式計算得各組分馬尾藻巖藻聚糖對膽酸鹽的吸附量。

膽酸鹽吸附率(%)=(1-C1/C0)×100

式中,C1-多糖溶液中膽酸鹽濃度(mg/mL);C0-空白溶液中膽酸鹽濃度(mg/mL)。

1.3 數據處理

實驗數據用SPSS 19.0軟件進行處理,采用平均值±標準差的形式表示。

2 結果與分析

2.1 HSP1的分離純化

如圖1所示,可以得到四個主要的糖峰,從左到右依次是F0、F1、F2、F3。F0是用蒸餾水洗脫得到的組分,未被纖維素交換,大多是中性糖,所以硫酸基團含量少,故本次實驗不對F0進行研究;NaCl溶液洗脫出來的是酸性糖,根據硫酸基團的含量不同進行洗脫,從而達到分離純化的效果。

圖1 DEAE-52纖維素層析柱洗脫曲線

2.2 亨氏馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯的化學組成分析

通過表1可知,五種組分均含有多糖、硫酸基、巖藻糖和糖醛酸,但含量占比不一樣。HSP0的多糖含量最大,高達37.87%,經過脫蛋白處理后,HSP1的多糖、硫酸基、巖藻糖含量均有所減少,而糖醛酸的含量升高了3.43%。由于不同濃度NaCl溶液洗脫,F1、F2、F3三種組分的多糖、硫酸基、巖藻糖和糖醛酸的含量存在差異。其中多糖含量從高到低分別是F2、F1、F3,F2比F3升高了6.72%;F2、F3的硫酸基、巖藻糖含量高于F1,F3的硫酸基含量比F1高13.25%,F2的巖藻糖含量比F1高12.56%;而F1糖醛酸的含量高于F2和F3,分別高出 20.89%和21.52%。

表1 五種馬尾藻巖藻聚糖的化學組成(%)

2.3 單糖組成分析

由表2可知,HSP0與F2均含有六種單糖,但各種單糖的含量存在差異。HSP0中含量最高的是葡萄糖,巖藻糖和半乳糖次之,百分含量分別為48.01%、22.03%和18.59%,葡萄糖所占比例高于其它單糖,幾乎占所有單糖的一半,其中含量最少的是鼠李糖,只有0.94%;在F2中,主要含有巖藻糖、半乳糖、甘露糖,百分含量分別為38.20%、34.72%、14.08%,其中巖藻糖所占比例遠高于其它單糖,含量最少的是鼠李糖,與HSP0一致。本實驗結果表明,經過分級純化的馬尾藻巖藻聚糖,糖鏈上巖藻糖、半乳糖的百分含量逐漸增大。

表2 HSP0和F2的單糖組成(%)

2.4 亨氏馬尾藻巖藻聚糖吸附膽酸鹽的作用

圖2為膽酸鹽標準曲線,三種膽酸鹽的標準曲線均具有良好的線性,R2均大于0.99。標準曲線分別為水合膽酸鈉:y=1.2088x+0.1444,R2=0.9948;甘氨膽酸鈉:y=1.2554x+0.1026,R2=0.9994;牛磺膽酸鈉:y=1.0028x+0.1157,R2=0.9982。

圖2 膽酸鹽標準曲線

如圖3可以看出,隨著HSP0濃度的增加,對三種膽酸鹽的吸附率增加。在HSP0的濃度為10 mg/mL后增長減緩,說明了HSP0與膽酸鹽吸附快接近飽和狀態。HSP0與水合膽酸鈉、甘氨膽酸鈉、牛磺膽酸鈉的吸附率也不同,吸附能力從大到小分別是水合膽酸鈉、甘氨膽酸鈉、?；悄懰徕c。從以上結果來看,HSP0有吸附膽酸鹽的能力。

圖3 不同濃度HSP0對吸附膽酸鹽的能力

根據前期預實驗的結果和多糖樣品的制取實際情況,選擇2、4 mg/mL兩個濃度的HSP1進行吸附膽酸鹽能力的實驗。如圖4,低濃度的HSP1吸附膽酸鹽的能力低于高濃度。結合圖3,HSP1結合膽酸鹽的能力比HSP0強,當濃度為2 mg/mL時,與HSP0相比,HSP1與水合膽酸鈉、甘氨膽酸鈉、?；悄懰徕c的吸附率分別增加了4.32%、0.48%、1.49%,當HSP1濃度為4 mg/mL時,與HSP0相比，HSP1與水合膽酸鈉、甘氨膽酸鈉、?；悄懰徕c的吸附率分別增加了5.62%、1.95%、1.80%。因為HSP1經過除褐藻膠、脫蛋白、除脂肪,使得巖藻聚糖純度提高,從而吸附膽酸鹽的能力提高。

圖4 HSP1吸附膽酸鹽的能力

根據DEAE-52纖維素洗脫多糖的實際情況,配制濃度為2 mg/mL的三種洗脫組分進行吸附膽酸鹽的實驗。由圖5可以看出,在相同濃度下,洗脫組分中F2、F3吸附膽酸鹽的能力明顯高于F1。F2、F3的硫酸基和巖藻糖含量都明顯大于F1,F1含有的硫酸基和巖藻糖較低,僅有5.31%、5.07%,F2、F3表現出的高效吸附膽酸能力與硫酸基和巖藻糖含量有關,這兩者含量越高,吸附膽酸鹽能力越強。

圖5 五種相同濃度的組分吸附膽酸鹽的能力

當五種組分濃度為2 mg/mL時,F3吸附水合膽酸鈉和甘氨膽酸鈉的能力最強,吸附率達到26.35%和11.35%,吸附能力由高到低依次是F3、F2、HSP1、HSP0、F1;F2吸附?；悄懰徕c的能力最強,吸附率達到13.36%,吸附能力由高到低依次是F2、F3、HSP1、HSP0、F1。HSP1吸附膽酸鹽的能力大于HSP0,這與HSP1純度高于HSP0有關。由于F2和F3經過DEAE-52纖維素陰離子層析柱,純度更高,推測馬尾藻巖藻聚糖體外吸附膽酸鹽的能力跟多糖本身純度有關。劉曉菲等[31]對茯苓多糖的結構及生物活性的研究表明,茯苓多糖純度越高,其生物活性越高,本次實驗結果與其一致。

3 結論

亨氏馬尾藻巖藻聚糖粗品經除蛋白之后通過DEAE-52纖維素,用不同濃度NaCl溶液洗脫得到的分離純化的F1、F2、F3?；瘜W組成分析顯示,多糖含量最高的是HSP0和F2,巖藻糖含量最高的是F2和F3,硫酸基含量最高的是F3和HSP0。根據液相色譜顯示,HSP0主要含有葡萄糖、巖藻糖和半乳糖,其中葡萄糖幾乎占所有單糖的一半,在F2中,主要含有巖藻糖、半乳糖、甘露糖,其中巖藻糖所占比例遠高于其它單糖,這兩種糖的主要區別在于葡萄糖、半乳糖、巖藻糖,尤其是葡萄糖,相差39.67%?？啡┍壬ū砻?HSP0結合膽酸鹽的能力隨著濃度的升高而增強,在10 mg/mL后趨近于飽和;當各組分馬尾藻巖藻聚糖濃度為2 mg/mL時,F2和F3結合膽酸鹽的能力最好,這與其含有較高的巖藻糖、硫酸基含量和糖的純度有關。本次實驗中,亨氏馬尾藻巖藻聚糖吸附膽酸鹽的機制尚不夠具體,還需進一步深入研究。