冷藏魚片中優勢腐敗菌的分離鑒定

趙欣宇,孫衛青,熊光權,喬 宇,吳文錦,李 新,丁安子,汪 蘭,*

(1.湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所,湖北省農業科技創新中心農產品加工研究分中心,湖北武漢 430064;2.長江大學生命科學學院,湖北荊州 434025)

隨著生鮮電商、連鎖餐飲、中央廚房等新零售業態的崛起,水產品的消費從鮮活逐漸轉向預制調理加工。預制水產品在冷藏過程中會腐敗變質,主要是由于水產品水分和蛋白質含量高,微生物容易大量繁殖。現有研究主要集中在優勢腐敗菌的分離鑒定和致腐能力的研究,特別是希瓦氏菌(Shewanella)和假單胞菌(Pseudomonasspp.)[1-3]。而氣單胞菌也是魚、貝、蝦蟹類等水產品的優勢腐敗菌之一。錢韻芳等[4]從氣調包裝凡納濱對蝦中分離純化了氣單胞菌,并對其致腐能力進行了研究,結果表明氣單胞菌能使凡納濱對蝦揮發性鹽基氮含量(Totalviablenitrogen,TVB-N)、三甲胺氮(Trimethylaminenitrogen,TMA-N)含量升高,從而產生異臭味物質;李婷婷等將無菌鰱魚塊接種溫和氣單胞菌,結果表明氣單胞菌能使魚肉TVB-N、TMA含量升高,細菌蛋白酶能使魚肉蛋白質、脂肪等分解成大量小分子物質,產生大量離子從而使其電導率升高,Ca2+-ATPase活性降低等造成魚肉的蛋白質等營養物質劣變[5-9]。

斑點叉尾鮰(Leiocassislongirostris)是中國主要的淡水經濟魚類之一,受到廣大消費者的青睞。近年來學者對冷藏鰱魚、冷藏鱘魚、冷藏金槍魚等[3,5,9-12]的優勢腐敗菌及相關研究較多,但對冷藏鮰魚的優勢腐敗菌的研究較少。本文以斑點叉尾鮰為原材料,將新鮮鮰魚于4 ℃無菌冷庫中取肉后真空包裝,放置于4 ℃冰箱中貯藏7 d。從腐敗后期魚肉中分離出優勢腐敗菌并對其進行細菌鑒定,以期為冷藏鮰魚片保鮮技術的研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮鮰魚 湖北省武漢市華南海鮮批發市場;麥康凱瓊脂培養基、血平板培養基、營養瓊脂培養基 青島海博生物技術有限公司;細菌生化微量鑒定 廣東環凱微生物科技有限公司;2×Taq PCR Master Mix細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒 天一輝遠生物科技有限公司;PCR板 愛思進生物技術(杭州)有限公司(AXYGEN)。

YX280型高壓蒸汽滅菌鍋 上海三中醫療器械有限公司;DL-CJ-2NDH型超凈工作臺 北京東聯哈爾儀器制造有限公司;BPC-150F型生化培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;WD-9406型膠片觀察燈 北京六一儀器廠;Mikro120 臺式離心機 廣州市華粵行儀器有限公司;Thermal Cycler2720型PCR儀 基因有限公司Applied Biosystem;DYY-6C型電泳儀 北京六一儀器廠;Gel DocTM XR+型紫外分析儀 美國伯樂BIO-RAD;3730XL型ABI 3730 基因有限公司Applied Biosystem。

1.2 實驗方法

1.2.1 優勢腐敗菌的分離純化 在4 ℃無菌冷庫中將鮰魚宰殺,去掉其頭、皮、刺及內臟,用無菌水將其沖洗干凈,手工取側線上方、背鰭附近的白肉約20 g,真空包裝后置于4 ℃冰箱中儲藏7 d。參照GB 4789.2-2016[13]的方法將適量魚肉于超凈工作臺中剪碎于裝有適量的生理鹽水的錐形瓶中搖勻,制成菌液。將菌液依次進行10倍梯度稀釋,取適當梯度的菌液1 mL于血平板培養基、營養瓊脂培養基中,培養腐敗菌,溫度為37 ℃,時長24 h。觀察并挑選各個平板上的優勢腐敗菌用平板劃線法[14]純化至形態特征穩定的菌種并編號。

1.2.2 革蘭氏染色及生化鑒定 將純化菌種進行革蘭氏鏡檢,觀察其形態。無菌條件下將純化菌落按照生化微量鑒定管說明書進行氧化酶、非麥芽糖、乙酰胺、硝酸鹽還原、西蒙氏檸檬酸鹽、DNA等生化鑒定[15-16]。

1.2.3 細菌DNA提取 采用細菌基因組提取試劑盒上方法提取細菌總DNA:取適量菌體,加入2 mL離心管中;加入567 μL的TE緩沖液,反復吹打使之重新懸浮。然后加入30 μL10%SDS和15 μL的蛋白酶K,混勻;37 ℃溫育1 h;加入100 μL 5 mol/L NaCl,充分混勻,再加入80 μL CTAB/NaCl溶液,混勻;65 ℃溫育10 min;加入等體積、體積比24∶1的氯仿∶異戊醇溶液,12000 r/min離心4～5 min;將上清液轉入一只新管中,加入0.6～0.8倍體積的異丙醇,輕輕混合直到DNA沉淀下來,12000 r/min離心10 min;加入1 mL 70%乙醇洗滌,12000 r/min離心10 min,棄乙醇;在潔凈工作臺中干燥,重溶于50 μL TE緩沖液或者去離子水中。

1.2.4 16S rDNA測序及構建系統發育樹 傳統的生化方法對微生物進行正確的分類存在較大的困難,而隨著分子生物學技術的發展核酸序列分析以及構建系統發育樹已被廣泛地應用于微生物的鑒定中,通過序列分析,可以快速準確地獲得基因序列,再通過系統發育樹的構建從而分析出微生物種類。該方法是以純化菌的DNA為模板,利用DNA條形碼技術,采用PCR方法擴增各純化菌的16S rDNA片段測序,測序后在將DNA序列在GeneBank進行比對(https://cipotato.org/genebankcip/)。引物為27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,反向:1492R:5′-TACGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3′。PCR擴增體系(30 μL):2×PCR Mix15 μL,DNA模板1 μL,上下游引物各1 μL,無菌水12 μL。PCR擴增程序[10]:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s;58 ℃退火30 s;72 ℃延伸45 s;35個循環;72 ℃末端延伸5 min;4 ℃保溫。將PCR擴增產物送至天一輝遠生物科技有限公司進行基因測序。將所得目的序列使用NCBI的BLAST程序對獲得的16S rDNA序列進行同源序列比對,合理選取相似性高的序列,最后使用MEGA7.0.26軟件(美國MEGA公司)的鄰接法(Neighbor joining)構建系統發育樹[17]。

2 結果與分析

2.1 細菌分離純化

從鮰魚背部取肉分離純化得到3株菌株,編號為x1-1、y1-1、y2-1。其中:菌株x1-1在血液瓊脂培養基上為圓形、濕潤、灰白色菌落,取單菌落革蘭氏鏡檢為革蘭氏陰性短桿菌(圖1A);菌株y1-1在營養瓊脂培養基上為圓形、光滑濕潤、乳白色菌落,取單菌落革蘭氏鏡檢為革蘭氏陰性短桿菌(圖1B);菌株y2-1在營養瓊脂培養基上為圓形、扁平濕潤、乳白色菌落,取單菌落革蘭氏鏡檢為革蘭氏陰性短桿菌(圖1C)。

圖1 三種腐敗菌的菌落特征、形態特征

2.2 生化鑒定

將純化的菌株接種至生化微量鑒定管中在37 ℃培養24 h,觀測其結果為:x1-1硝酸鹽還原、乙酰胺、非木糖、西蒙氏檸檬酸鹽、DNA、OF為陰性,精氨酸、非麥芽糖、非甘露糖、氧化酶為陽性;y1-1硝酸鹽還原、非木糖、西蒙氏檸檬酸鹽、DNA、OF為陰性,精氨酸、乙酰胺、非麥芽糖、非甘露糖、氧化酶為陽性;y2-1乙酰胺、非木糖、非甘露糖、西蒙氏檸檬酸鹽、DNA、OF為陰性,硝酸鹽還原、精氨酸、非麥芽糖、氧化酶為陽性。與《常見細菌系統鑒定手冊》[15]比對表明:x1-1與嗜水氣單胞菌的生化特性基本一致;y1-1與維氏氣單胞菌的生化特性基本一致;y2-1異嗜糖氣單胞菌的生化特性基本一致。結果見表1。

表1 純化菌種生化鑒定結果

2.3 16S rDNA基因測序及系統發育樹分析

分別以菌株x1-1、y1-1、y2-1的DNA為模板,通過PCR擴增細菌16S rDNA片段。通過電泳檢測發現:三個菌株均約在1500 bp處有明顯目的條帶(圖2)。進一步對16S rDNA測序表明:菌株x1-1目的片段大小為1398 bp;菌株y1-1目的片段大小為1408 bp;菌株y2-1目的片段大小為1409 bp。將各菌落的16S rDNA片段通過Blast檢索系統進行序列比對分析以及構建系統進化樹,結果表明:x1-1與嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)親緣關系最近,達99.9%(圖3A);y1-1與維氏氣單胞菌(A.veronii)親緣關系最近達99.79%(圖3B);y2-1異嗜糖氣單胞菌(A.allosacharophila)親緣關系最近,達99.8%(圖3C)。

圖2 純化菌種16S rDNA電泳圖

圖3 三種腐敗菌的系統進化樹

3 討論

氣單胞菌屬(Aeromonasspp.)在自然界中廣泛存在,主要來源于水源、土壤以及人的糞便中,可在0～5 ℃生長,因此在水產品冷藏的條件下極易成為優勢菌種[18],是水生動物中主要的致病菌之一,能導致多種魚類感染患病,一旦感染將迅速流行,造成巨大的經濟損失[19]。現階段對氣單胞菌屬的研究主要集中于水生動物,范圍涉及嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)、維氏氣單胞菌(A.veronii)、豚鼠氣單胞菌(A.caviae)、溫和氣單胞菌(A.sobria)等。如蔣慧亮等[20]從4 ℃冷藏的河蚌肉中分離出優勢腐敗菌是嗜水氣單胞菌(A.hydrophila);焦維楨等[21]從真空包裝的冷藏鱘魚中分離得到優勢腐敗菌為維氏氣單胞菌(A.veronii)和路德維希腸桿菌(Enterobacterludwigii),與本實驗結果基本一致。但根據最新對冷藏斑點叉尾鮰優勢腐敗菌的研究[22]表明4 ℃下希瓦氏菌(Shewanallaspp)是鮰魚4 ℃冷藏中主要的致腐菌群,這可能是由于該實驗與本實驗在魚肉的取樣環境、儲藏時間、儲藏環境、純化程度等因素存在差異導致。

腐敗微生物能夠分解魚肉的脂肪和蛋白質等營養物質,積累導致魚肉產生不愉快氣味甚至變色、變味等的胺、吲哚、硫化氫、有機酸、醛和酮等腐敗代謝產物[23]。結合其他學者研究[17,23-25]及本實驗生化鑒定結果表明:三種氣單胞菌均為非發酵型革蘭氏陰性菌,均可利用葡萄糖、木糖作為碳源,但不利用麥芽糖、甘露糖、西蒙氏檸酸鹽;可利用蛋白質中的精氨酸等作為氮源,從而這三種氣單胞菌消耗魚肉中的蛋白質、糖類等營養物質,使魚肉變質且自身大量繁殖。根據陳稚峰等[16,26-29]對魚源、蝦源中分離出的氣單胞菌的群體感應現象的研究表明:氣單胞菌能夠分泌高絲氨酸內酯(AHLs),促進蛋白酶的分泌及自身生物膜的形成,進而使食物中的蛋白質降解成小分子肽等,增強自身抗逆性,加速水產品腐敗。根據李苗云等[30]對冷卻豬肉貯藏過程中分離出的主要腐敗菌的聚類分析的研究表明:影響肉品腐敗不僅僅是單獨的某一類微生物作用的結果,而是多種腐敗菌相互作用所導致的。單一的氣單胞菌的致腐能力并不強,但在混合細菌(包括氣單胞菌、熱殺索絲菌、腸桿菌科細菌和假單胞菌)的共同作用下,肉品腐敗速度加快,并且在導致產品腐敗的進程中,氣單胞菌對腐敗的群體效應起關鍵作用。即氣單胞菌可能與其他腐敗菌共同腐敗,但這些仍需要進一步研究。

4 結論

綜上所述,本實驗結合細菌形態觀察、生化鑒定、16S rDNA序列測定等方法共同確定冷藏鮰魚片優勢腐敗菌的種類,結果真實可靠。研究表明:在冷藏條件下,鮰魚片的優勢腐敗菌主要為氣單胞菌屬中的嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)、異嗜糖氣單胞菌(Aeromonasallosaccharophila)。

研究真空包裝的冷藏鮰魚片中的優勢腐敗菌,不僅能夠了解真空包裝以及低溫條件下對腐敗菌生長情況的影響,還能了解真空包裝以及低溫條件下仍能導致鮰魚肉質腐敗的腐敗菌種類,可為鮰魚在商品流通過程中肉質腐敗的防控提供研究方向。