基于高通量技術分析龍門傳統蜂蜜醋微生物多樣性

邱楚茹,潘偉杰,林 捷,*,吳安萍,陳秋雯,唐倩彤,付章平

(1.華南農業大學食品學院,廣東廣州 510642;2.惠州市龍門縣富潤康食品有限公司,廣東惠州 516800)

以蜂蜜為原料釀制保健醋,不僅具有很好的營養價值,同時為蜂蜜的深加工提供了一條新途徑[1]。龍門蜂蜜醋是以中華蜂采集的荔枝蜜為原料,混合菌發酵后的產物,含有原蜂蜜的營養成分及微生物發酵產生的新營養物質,而且風味獨特、香氣醇厚、酸甜適宜,贏得人們喜愛和關注[2-4]。傳統方法生產的龍門蜂蜜醋,微生物菌種源自多年來自然篩選富集,適合該生態環境下生長,是多菌種長期共生形成的有穩定菌群結構的混合菌種。近年來,隨著信息技術和測序方法的快速發展,利用新一代測序技術(Next Generation Sequencing)研究物質的宏基因組學(Metagenomics),能快速準確的得到豐富的生物數據和大量的微生物研究信息,從而成為研究微生物多樣性和群落特征的重要手段[5-6]。目前,國內用于蜂蜜醋發酵菌株常用Acetobacterpasteurianus、Acetobacterschutzenbachii、Acetobacterrancens、Acetobacteraceti、Lactobacillusacidophilus,且單一菌種或幾種已知菌種復配,羅萍等[4]用菌膜擴培液進行發酵,但并未分析混合菌種的生物多樣性。本實驗采用宏基因組學(Metagenomics)對傳統龍門蜂蜜醋進行分析,通過功能基因篩選和測序分析等研究手段[7],將比較快速且全面準確地掌握蜂蜜醋菌種的菌群組成及菌種比例,并研究優勢菌種的主要代謝通路。通過Illumina PE150測序,對龍門地區的蜂蜜醋樣品中微生物多樣性進行分析,同時分析蜂蜜醋的有機酸、氨基酸等成分,以期為龍門地區傳統蜂蜜醋中微生物菌種資源的發掘、利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蜂蜜(荔枝蜜,70～75 Brix)和蜂蜜醋菌種(蜂蜜醋發酵液和菌膜1∶1混合物) 惠州市龍門縣富潤康食品有限公司提供,采樣后置于無菌容器保藏于4 ℃冰箱備用;其他試劑均為分析純。

HV-50滅菌鍋 日本HIRAYAMA公司;SPX-300-GB生化培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;SW-CJ-IFD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;WYT手持糖度計 成都泰華光學有限公司;LRH-150F臺式pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;L-8800型全自動氨基酸分析儀 日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蜂蜜醋菌種培養 配制15 Brix蜂蜜水于已滅菌三角瓶中,80 ℃滅菌20 min后備用,在超凈工作臺接入5%種子液(蜂蜜醋發酵液和菌膜按質量比1∶1混合打碎備用),用六層無菌紗布封口,置于30 ℃恒溫培養箱,靜置培養7 d。

1.2.2 蜂蜜醋菌種宏基因組測序分析 蜂蜜醋菌種按照1.2.1活化后,用冰袋保存送樣,委托諾禾致源公司測定。送樣后,諾禾致源公司將檢測合格的DNA樣品,進行文庫檢測以及文庫構建,檢測合格的文庫將采用 Illumina PE150 進行測序,測序得到的下機原始數據(Raw Data)用于后期信息分析。DNA樣品檢測:瓊脂糖凝膠電泳(AGE)分析DNA的純度和完整性[9];Qubit對DNA濃度進行精確定量。

文庫構建及庫檢:檢測合格的DNA樣品用Covaris超聲波破碎儀隨機打斷成長度約為350 bp的片段,經末端修復、加A尾、加測序接頭、純化、PCR擴增等步驟完成整個文庫制備。使用Qubit2.0進行初步定量,稀釋文庫至2 ng/μL,隨后使用Agilent 2100對文庫的insert size進行檢測,insert size符合預期后,使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量(文庫有效濃度>3 nM),以保證文庫質量。

1.2.3 蜂蜜醋發酵 按照1.2.1活化處理后置于30 ℃恒溫培養箱,靜置培養3個月。

1.2.4 蜂蜜醋pH測定方法 pH計測定。

1.2.5 蜂蜜醋總酸的測定 參考食品安全國家標準《GB/T 5009.41-2003》對釀造食醋的總酸進行測定。

1.2.6 非揮發酸的測定 參考食品安全國家標準《GB 18187-2000》對釀造食醋非揮發酸進行測定。

1.2.7 蜂蜜醋游離氨基酸測定 參考文獻[8],樣品測定條件:進樣體積:0.05 mL;稀釋度:2;色譜柱:LCA K07/Li;檢測波長:570 nm+440 nm;流動相:檸檬酸鋰A=pH2.90;B=pH4.20;C=pH8.00;溫度:38～74 ℃梯度升溫60 min;流速:洗脫泵0.45 mL/min+衍生泵0.25 mL/min。

2 結果與分析

2.1 蜂蜜醋菌種總DNA提取

蜂蜜醋樣品總DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1所示,主帶清晰且無500 bp以下集中帶,DNA條帶無明顯拖尾現象,無雜帶,說明DNA純度較高。利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒檢測蜂蜜醋樣品的總DNA濃度為12.8 ng/μL,表明不存在DNA的降解、凋亡、污染或殘留等現象,其質量達到二代測序文庫(Meta文庫)有效濃度>3 nM的要求[10]。

圖1 蜂蜜醋樣品總DNA電泳檢測結果

2.2 高通量測序數據統計分析

采用Illumina HiSeq測序平臺測序,共獲得7697.02 Mbp的下機原始數據(Raw Data),對下級數據中質量值較低的序列進行過濾,得到最終的有效數據結果見表1。經過質控得到7682.28 Mbp的有效數據(Clean Data),經過單樣品組裝及混合組裝后,共得到14847804 bp的Scaftigs。采用MetaGeneMark軟件對得到的Scaftigs進行基因預測,經過去冗余的(高度相似)基因后,共獲得13490個翻譯對象(ORFs),總長為12.08 Mbp,其中完整基因的個數為11975,所占比例為88.77%。非冗余基因集(Unigene)與MicroNR庫進行blastp比對,運用LCA算法進行物種注釋,注釋到屬和門的比例分別為68.27%、99.61%,12374(91.73%)個ORFs比對到KEGG數據庫。

表1 蜂蜜醋菌種樣品中數據產出統計信息

2.3 蜂蜜醋菌群組成及菌種比例分析

使用genes(非冗余的連續基因編碼的核酸序列)與各功能數據庫進行比對·DIAMOND軟件[11]將Unigenes與從NCBI的NR(Version:2018.01)數據庫中抽提出的細菌(Bacteria)、真菌(Fungi)、古菌(Archaea)和病毒(Viruses)序列進行比對(blastp,evalue≤1e-5)[12],共13490個Unigenes可以得到注釋信息[9]。能夠注釋到NR數據庫的翻譯對象(ORFs)的數目為12865(95.37%),在能夠注釋到NR數據庫的ORFs中,注釋水平達到界的比例為99.84%,將蜂蜜醋菌種中的微生物歸屬于兩大生物界中,大多數序列屬于細菌界(97.1%),另外一小部分序列被分配到真菌界(0.01%),此外還有2.85%序列未匹配到以上任何生物界中,這意味著與當前生物信息數據庫中已知的生物序列沒有相關性或者親緣關系非常遠[13]。

從表2可知,蜂蜜醋菌種中大部分歸屬于變形桿菌門,占比為96.77%,酸桿菌門占比0.05%,剩余的序列占比較小,且在發酵過程中不被期望。從表2可知,蜂蜜醋菌種在Komagataeibacter、Acetobacter、Gluconacetobacter、Gluconobacter、Sphingomonadales、Rhizobiales等都有同源序列分布。從圖2可知,其中Komagataeibacter菌屬占蜂蜜醋菌種的Unigene共有57.86%,主要包括Komagataeibacterxylinus(4.22%)、Komagataeibacterkakiaceti(3.90%)、Komagataeibactereuropaeus(4.20%)、Komagataeibacterhansenii(3.31%)等,無法分類的Komagataeibacter有37.78%;與Gluconobacter屬相似序列的Unigene占1.24%;與Acetobacteraceae屬有相似序列包括無法識別的Acetobacteraceae的26.23%占總Unigene的31.57%;與Gluconacetobacter菌相似的有1.99%包括Gluconacetobacterdiazotrophicus(1.00%)、Gluconacetobactersp. SXCC-1(0.99%),與其他物種相似性較少。蜂蜜醋菌種與前人報道過的紅茶菌菌種組成相似[14-16]。

表2 蜂蜜醋菌種主要門與屬的分布及豐度

圖2 蜂蜜醋菌種宏基因組Unigene在NR數據庫中物種分布圖

其中含量較少的產酸菌有歸類于酸桿菌門,乳桿菌屬的Granulicellamallensis。在紅桿菌目包含了親乳雙歧桿菌(Gemmobacternectariphilus)與嗜中乳桿菌(Rubellimicrobiummesophilum)被發現姚栗等是芝麻香型白酒大曲發酵末期的優勢菌種[17]。以及酸單胞菌屬的單一菌種甲醇酸單胞菌(Acidomonasmethanolica),其在四川麩醋和紅茶菌中,甲醇酸單胞菌能利用甲醇、乙醇產甲酸、乙酸,利用可發酵性糖產酸,提高食醋發酵過程中的產酸率[18-19]。

2.4 蜂蜜醋菌種主要代謝通路分析

如表3所示,在蜂蜜醋菌種中碳水化合物代謝主要包括丙酮酸代謝、戊糖磷酸途徑、糖酵解/糖異生、淀粉和蔗糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝等,這些途徑的中間代謝產物為短鏈脂肪酸、乙酸乙酯的合成提供原料,同時前三種基礎代謝途徑產生大量的乙酸、丁酸、檸檬酸、葡萄糖酸等有機酸使發酵液pH逐漸降低,醋的風味逐漸豐富。從菌種參與度方面看,Komagataeibacter菌屬是主要的碳水化合物代謝承擔者,其中木醋桿菌參與每條碳水代謝途徑,參與度依次是Komagataeibacterkakiaceti、Komagataeibacterhansenii、Komagataeibactereuropaeus,并且也是占蜂蜜醋菌種比例前五位的物種,值得注意的是Komagataeibacterrhaeticus菌種比例不高但參與三分之二的碳水代謝途徑,另一方面,Acetobacter菌屬與Gluconobacter菌屬參與度低,推測原因:前者不是直接以糖產酸,后者在菌種比例含量低。Gluconacetobacter菌屬中Gluconacetobactersp. SXCC-1參與度也較高,可能與其特殊代謝方式有關[20]。另外,蜂蜜醋發酵3 個月后,pH達到2.13,總酸含量為33.5 g/L,非揮發酸含量達到9.82 g/L,非揮發酸占總酸的比例不低,從主要功能菌種來分析,Komagataeibacter菌屬通過多條碳水化合物代謝途徑產生不揮發的較乙酸柔和的酸,例如:丁酸、丙酸、葡萄糖酸、丙酮酸、異檸檬酸等。依據宏基因組分析結果,選取6株菌的含量最高的菌種作為參與菌種,分析其碳水化合物代謝途徑與產物,發現代謝產物含有豐富的非揮發酸,與蜂蜜醋化學分析結果吻合[21]。

表3 碳水化合物代謝途徑

從表4得知,在氨基酸代謝途徑中,有14種氨基酸代謝途徑,承擔氨基酸代謝功能的依舊是Komagataeibacter菌屬,Komagataeibacterxylinus參與每條氨基酸代謝途徑,參與度依次是Komagataeibactereuropaeus、Komagataeibacterrhaeticus、Komagataeibacterhansenii、Komagataeibacternataicola。由此,可知Komagataeibacter菌屬是蜂蜜醋發酵過程中,主要功能微生物群,是蜂蜜醋風味產物的生產者。Komagataeibacter菌屬主要功能是不完全氧化糖類、糖醇類和醇類生成相應的糖醇、酮和有機酸,氧化乙醇生成乙酸,合成纖維素膜抵御低pH等不良環境。Gluconacetobactersp. SXCC-1參與度也較高,推測與其直接利用糖產酸的發酵特性有關,氨基酸代謝途徑產生其特征風味物質的前體,徐偉等[22]發現其為紅茶菌的優勢菌種。依據宏基因組分析結果,選取6株菌的含量最高的菌種作為參與菌種,分析其氨基酸代謝途徑與產物,發現代謝產物與氨基酸自動分析儀結果吻合[21]。在氨基酸的生物合成中,檸檬酸循環、糖酵解等途徑中的關鍵中間體是氨基酸碳骨架形成的主要前體。TCA循環中的α-酮戊二酸和草酰乙酸是生成谷氨酸族和天冬氨酸族氨基酸的主要合成前體;糖酵解中甘油酸-3-磷酸、丙酮酸和磷酸烯醇式丙酮酸是生成絲氨酸族、丙氨酸族和芳香族氨基酸族的氨基酸合成前體[23]。因此,參與TCA循環與糖酵解途徑的菌種也參與氨基酸代謝途徑。優勢菌種木醋桿菌通過纈氨酸,亮氨酸和異亮氨酸的生物合成途徑產生短鏈脂肪酸3-甲基-丁酸(異戊酸)及2-甲基-丙酸(異丁酸)的前體──異亮氨酸、亮氨酸,進一步合成短鏈脂肪酸,豐富了蜂蜜醋的風味。

表4 氨基酸代謝途徑與蜂蜜醋中氨基酸含量

釀造食醋的滋味與其所含的氨基酸種類和含量有著一定的聯系,不同的氨基酸呈現不同的味覺效果,食醋中所檢測出來的氨基酸種類一共可以分為四類。分別是澀味氨基酸、甜味氨基酸、苦味氨基酸和鮮味氨基酸[24]。其中苦味氨基酸包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸;鮮味氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸;甜味氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、蘇氨酸等[25]，總游離氨基酸含量為0.813 μg/mL,甜味、鮮味氨基酸含量為0.476 μg/mL,占總氨基酸含量約60%。雖然苯丙氨酸本身呈苦味,但其在濃度為0.5～5.0 mmol的范圍內,對谷氨酸鈉與氯化鈉混合物的味覺有顯著的改善作用[26]。因此蜂蜜醋中氨基酸主要貢獻“鮮、甜”的滋味,且還含有5種人體必需氨基酸。

3 結論

本研究對蜂蜜醋菌種中的微生物群落、主要代謝途徑及風味代謝產物進行初步的分析。結果表明:Komagataeibacter菌屬及Gluconacetobacter菌屬是產生風味物質的功能核心微生物,Komagataeibacter是蜂蜜醋微生態中的優勢菌種。兩個菌屬通過碳水化合物代謝與氨基酸代謝產生乙酸、葡萄糖酸、丁酸、氨基酸、短鏈脂肪酸等特征風味物質。本研究有助于闡明蜂蜜醋微生物代謝物的形成機制,進一步提高生產效率,改善并穩定醋的品質。