溪蜜柚柚皮黃酮提取工藝優化

晏 幸,戴宇琪,歐麗明,胡 陽,2,3,魏好程,2,3,倪 輝,2,3,陳艷紅,2,3,*

(1.集美大學食品與生物工程學院,福建廈門 361021;2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室,福建廈門 361021;3.廈門市食品生物工程技術研究中心,福建廈門 361021)

琯溪蜜柚(Citrusmaxima)是我國一種名優柚類植物,其果實營養豐富、肉質脆嫩、風味獨特[1],在我國福建省、廣東省、江西省等東南省份大量種植[2]。僅2016年福建省漳州市平和縣種植面積就達4.33萬公頃,年產量120萬噸,產值超過50億元[3]。隨著琯溪蜜柚種植業及加工產業不斷發展,產生了大量殘次廢果及加工副產物,亟待開發利用。柚皮富含黃酮類物質,柚皮是琯溪蜜柚殘次廢果及加工副產物的最主要構成。相關研究表明,來源于柚類等柑橘水果的黃酮類物質可作為天然食品添加劑、食用色素和風味改良劑[4],并且可防治心腦血管疾病、抗炎、抗過敏及預防糖尿病等[5]。因此,提取柚皮黃酮類物質是對琯溪蜜柚殘次廢果及加工副產物進行開發利用的重要途徑。

柚皮黃酮類物質提取方法主要有水提法、堿提法、有機試劑提取法、超臨界流體萃取、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法等[6-12]。不同的方法提取不同品種的柚皮中黃酮含量有一定的差別。吳志強等[13]采用表面活性劑協同微波提取胡柚皮中的總黃酮,得到胡柚總黃酮的提取率為4.35%。黃藝等[14]用微波提取沙溪蜜柚柚皮中總黃酮,總黃酮的提取率為0.272%。公衍玲等[15]采用星點設計-響應面優化乙醇提取化州柚柚皮總黃酮工藝,總黃酮得率為1.03%。其中,超聲輔助提取法利用超聲波輻射壓強產生的機械效應、空化效應、和熱效應共同破壞組織的細胞壁,加速物質擴散溶解,具有操作簡單、提取時間短、提取量大、提取效率高等特點,是天然產物提取常見方法[16-18]。雖然部分研究優化了琯溪蜜柚的柚皮苷提取工藝[19],但目前尚沒有對琯溪蜜柚果皮黃酮的提取工藝進行系統優化研究。對于提取工藝的優化,常用的方法包括單因素實驗方法與多因素實驗方法,其中,響應面分析法是一種常用多因素實驗優化方法,可以通過少數試驗和較短時間在二次方水平及各因子交互作用的角度優化工藝條件[20]。

基于以上研究背景,本研究采用超聲波輔助法提取琯溪蜜柚柚皮的黃酮,綜合運用單因素和響應面分析法優化工藝條件,為琯溪蜜柚總黃酮提取提供工藝參考,促進琯溪蜜柚殘次廢果及加工副產物的綜合利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

琯溪蜜柚柚皮 琯溪蜜柚購買于福建省漳州市平和縣；蘆丁(濃度≥95.0%) 國藥集團化學試劑有限公司;無水乙醇(分析純) 上海沃凱生物技術有限公司;亞硝酸鈉、九水合硝酸鋁、氫氧化鈉等均為分析純 西隴化學股份有限公司。

JP-500C型高速粉碎機 永康市久品工貿有限公司;KQ5200DE型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;Epoch 2T型酶標儀 美國伯騰儀器有限公司產品;BS 124S型電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 柚皮黃酮提取工藝 實驗前將琯溪蜜柚柚皮剝下,清洗干凈,剪成1 cm2的小塊,曬干至恒重,粉碎,過80目篩制成柚皮粉備用。精確稱取2.00 g柚皮粉,以一定的液料比下加入一定濃度的乙醇溶劑,在一定的溫度和一定的超聲頻率下超聲提取一定的時間,趁熱抽濾,收集提取液用超純水定容至100 mL,此為得到的黃酮提取液。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 液料比對超聲輔助提取柚皮黃酮的影響 稱取2.00 g柚皮粉,以70%乙醇為提取溶劑,分別設定液料比為15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1 mL/g,在超聲溫度30 ℃、超聲功率160 W的條件下超聲提取50 min,趁熱進行抽濾,收集提取液用超純水定容至100 mL,做三組平行實驗,測定黃酮含量。

1.2.2.2 乙醇濃度對超聲輔助提取柚皮黃酮提取的影響 稱取2.00 g柚皮粉,在液料比30∶1 mL/g,提取時間50 min,提取溫度為30 ℃,超聲功率為160 W,分別采用10%、30%、50%、70%、90%的乙醇進行提取,樣品超聲后趁熱進行抽濾,收集提取液用超純水定容至100 mL,做三組平行實驗,測定黃酮含量。

1.2.2.3 超聲提取功率對柚皮黃酮提取的影響 稱取2.00 g柚皮粉,以70%乙醇為提取溶劑,液料比30∶1 mL/g,提取溫度為30 ℃,分別設定超聲功率為120、140、160、180、200 W的條件下超聲提取50 min,趁熱進行抽濾,收集提取液用超純水定容至100 mL,做三組平行實驗,測定黃酮含量。

1.2.2.4 超聲提取溫度對柚皮黃酮提取的影響 稱取2.00 g柚皮粉,以70%乙醇為提取溶劑,液料比30∶1 mL/g,設定提取溫度為20、25、30、35、40 ℃、超聲功率160 W的條件下超聲提取50 min,趁熱進行抽濾,收集提取液用超純水定容至100 mL,做三組平行實驗,測定黃酮含量。

1.2.2.5 超聲提取時間對柚皮黃酮提取的影響 稱取2.00 g柚皮粉,以70%乙醇為提取溶劑,液料比30∶1 mL/g,提取溫度30 ℃,超聲功率為160 W,超聲提取時間分別為10、30、50、70和90 min,樣品超聲后趁熱進行抽濾,收集提取液用超純水定容至100 mL,做三組平行實驗,測定黃酮含量。

1.2.3 響應面優化試驗 采用Design-Expert 8.06軟件的Box-Behnken設計原則設計試驗。在單因素實驗結果基礎上,選取了乙醇濃度、超聲功率、溫度3個因素為優化參數,以黃酮提取率為響應值設計試驗,試驗因素和水平如表1。

表1 響應面試驗因素與水平設計

1.2.4 總黃酮含量測定方法

1.2.4.1 標準曲線的繪制 精確稱取 0.04 g蘆丁標準品,置于100 mL容量瓶中,用30%乙醇溶解定容,制成濃度為0.40 mg/mL的標準品溶液。把0.40 mg/mL的蘆丁標準品溶液用30%乙醇溶液稀釋成0.00、0.08、0.16、0.24、0.32、0.40 mg/mL不同的梯度濃度。取不同濃度的標準液各5 mL置于25 mL比色管中,向其中分別加入2 mL 30%乙醇溶液,充分搖勻,加入1 mL 5%的NaNO2溶液,混勻后靜置5 min。再加入1 mL 10%的 Al(NO3)3溶液,混勻后放置5 min,然后加入10 mL 4% NaOH,搖勻,最后加入30%乙醇定容到25 mL,充分搖勻。混合后靜置15 min。每組溶液在510 nm下的測定吸光度值。以蘆丁標準液濃度(x)為橫坐標,吸光度(y)為縱坐標繪制標準曲線,求得回歸曲線方程線性回歸方程:y=1.0685x+0.0356,R2=0.999。

1.2.4.2 提取液中黃酮提取率的測定 在“1.2.1”獲得的黃酮提取液中取5 mL提取液于25 mL比色管中,按照“1.2.4.1”方法測得吸光度值,根據蘆丁標準曲線按照式(1)計算提取液中黃酮的提取率。

式(1)

式中:C為由回歸方程算得的樣液濃度(mg/mL)；V1為測定時的定容體積(mL);V2為提取液定容體積(mL);M為稱取樣品的質量(g);V0為用于測定的提取液體積(mL)。

1.3 數據處理

通過Office Excel 2013(微軟,美國)軟件進行平均值、標準偏差的計算,折線圖的繪制;通過Design-Expert 8.06軟件的Box-Behnken設計原則進行響應面試驗設計及數據分析。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 液料比對超聲輔助提取柚皮黃酮的影響 不同的液料比對黃酮提取率的影響如圖1所示,琯溪蜜柚柚皮黃酮提取率隨液料比的升高而不斷增加,當液料比30∶1 mL/g時黃酮的提取率達到最大值4.89%之后不再增加。出現這種情況可能因為溶劑用量的增加有利于黃酮物質溶解析出,但是隨著擴散體系達到平衡時,繼續增大溶劑量會增加雜質的浸出,其對提取率的增加效果減小[21-22]。

圖1 液料比對黃酮提取率的影響

2.1.2 乙醇濃度對超聲輔助提取柚皮黃酮的影響 不同的乙醇濃度對黃酮的提取率的影響如圖2所示,隨著乙醇濃度的增高,黃酮提取率先增大而后變小,在乙醇濃度為70%時黃酮提取率達到最大值4.83%。出現這種情況可能因為一開始乙醇濃度較低時,水的含量相對較高,使黃酮提取率較低。當黃酮提取率達到最大之后,繼續增加乙醇濃度時,溶劑的極性變小,黃酮類物質溶解度降低,從而導致黃酮提取率降低[21]。

圖2 乙醇濃度對黃酮提取率的影響

2.1.3 超聲提取功率對柚皮黃酮提取的影響 不同的提取功率對總黃酮的提取率的影響如圖3所示,隨著超聲功率的升高,黃酮的提取率從先上升后趨于平穩最后下降,在超聲功率為160 W時黃酮提取率達到最大值4.88%。這可能是因為超聲功率的增大可以加速分子間震動,增大物質與溶劑的接觸面積,加快了分子擴散速率,使得黃酮的提取率增加。當超聲功率較高時,使得溶液溫度也較高,破壞了黃酮分子的結構,導致黃酮穩定性下降,部分被氧化,使得黃酮的提取率降低[23-24]。

圖3 超聲功率對黃酮提取率的影響

2.1.4 超聲提取溫度對柚皮黃酮提取的影響 不同的超聲提取溫度對黃酮的提取率的影響如圖4所示,隨著超聲溫度的升高,黃酮的提取率先升高后趨近于平穩,在超聲溫度為30 ℃時黃酮提取率達到最大值為4.85%。出現這種情況可能因為超聲溫度升高可加快分子擴散速率,從而促進黃酮類物質析出,然而超聲溫度過高也會破壞部分黃酮結構并增加其它非黃酮物質析出,影響黃酮提取率,使得黃酮提取率下降[22]。

圖4 超聲溫度對黃酮提取率的影響

2.1.5 超聲處理時間對柚皮黃酮提取的影響 不同的超聲提取時間對黃酮的提取率的影響如圖5所示,隨著超聲時間的增加,黃酮的提取率先增大后下降,當超聲時間到達50 min時,黃酮提取率達到最高4.88%,隨著時間的延長,黃酮提取率緩慢下降。這可能是因為超聲波能產生強烈空化效應和攪拌作用,隨著超聲時間延長,增加溶劑穿透力,加速溶質析出,總黃酮逐漸溶于乙醇提取液,得率逐漸增大。而超聲時間超過50 min,一方面溶劑逸出,黃酮類化合物已經完全溶出,另一方面總黃酮結構可能受到破壞,導致提取率下降[21-22,25-26]。

圖5 提取時間對黃酮提取率的影響

注:*表示影響顯著(P<0.05);**表示影響極顯著(P<0.01)。

2.2 響應面分析法優化試驗

根據單因素試驗結果,在最佳液料比為30∶1 mL/g,超聲提取時間為50 min下,采用Box-Behnken設計對乙醇濃度(A)、超聲功率(B)和超聲溫度(C)進行響應面優化,結果見表2,多元回歸擬合得到提取得率(Y)與乙醇濃度(A)、超聲功率(B)和超聲溫度(C)的回歸方程為:y=-14.162+0.297A+0.097B+0.060C-1.462×0-4AB+2.925×10-4AC+1.316×10-4BC-2.098×10-3A2-2.797×10-4B2-1.433×10-3C2。

表2 響應面試驗設計與結果

圖7 乙醇濃度、超聲溫度對黃酮提取率的響應面圖和等高線圖

表3 二次回歸模型方差分析

圖6 乙醇濃度、超聲功率對黃酮提取率的響應面圖和等高線圖

圖8 超聲功率、超聲溫度對黃酮提取率的響應面圖和等高線圖

2.3 提取工藝條件的優化和驗證

通過Design-Expert 8.06 軟件對二次多項式回歸方程進行分析檢測得出的最優條件是乙醇濃度67.47%、超聲頻率是163.83 W、超聲溫度35.19 ℃,在該條件下黃酮的提取率最高4.84%。根據實際情況考慮,將最佳的工藝調整為乙醇濃度為67%,超聲頻率為163 W,超聲溫度為35 ℃,在此條件下重復三次試驗測得的黃酮提取率為4.90%,試驗結果與理論結果非常接近,說明響應面法所得的優化提取工藝參數可靠有效。公衍玲等[15]采用星點設計-響應面優化乙醇提取柚皮中的總黃酮工藝,總黃酮得率為1.032%。黃建蓉等[27]采用響應面法對超聲輔助提取柚皮中總黃酮的工藝進行優化,總黃酮提取率為5.301%。與相關文獻對比,本實驗采用響應面法優化琯溪蜜柚柚皮黃酮提取高于大部分文獻報道的提取率,而與黃建蓉優化得到的提取量相當?？赡芤驗槭遣煌蔫肿悠贩N不同,所含有的黃酮含量不同,因此優化出的響應面結果會有所差異。該結果為琯溪蜜柚果皮黃酮的提取利用提供了工藝參考。

3 結論

本實驗運用了超聲波輔助乙醇法提取琯溪蜜柚柚皮中的黃酮,通過實驗發現琯溪蜜柚柚皮黃酮的最佳提取工藝為液料比30∶1 mL/g、乙醇濃度67%、超聲頻率是163 W、超聲溫度35 ℃和超聲提取時間為50 min。在此條件下,進行了三次平行試驗后實測琯溪蜜柚柚皮黃酮提取率為4.90%。該方法運用于琯溪蜜柚柚皮黃酮的提取中工藝簡單,效果好,可為進一步的實驗研究奠定基礎。