復合酶催化強化浸提桑葉黃酮類物質研究

詹 力,王星敏,2,*,唐付杰,李仁炳

(1.重慶工商大學環境與資源學院,重慶 400067;2.重慶市特色農產品加工儲運工程技術研究中心,重慶 400067)

黃酮類化合物屬植物次生代謝產物[1],作為功能成分廣泛應用于藥物、保健食品及化妝品開發等。藥食同源物桑葉含有黃酮類、生物堿類、多糖類等[2]成分,而蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷是桑葉黃酮類物質的代表,具有降血壓[3]、抗氧化[4]等藥理活性,臨床上用于高血壓病及糖尿病的輔助治療[5]?，F有桑資源黃酮類物質開發利用技術包括有機溶劑提取法、微波輔助法、超聲提取法、酶提取法及超臨界萃取法等[6],孫蓮等[7]采用超聲波提取桑葉中黃酮類物質,測得蘆丁含量1.01 mg/g、異槲皮苷0.74 mg/g、紫云英苷0.23 mg/g;邸學等[8]采用有機溶劑萃取法檢測到桑葉中蘆丁含量0.13 mg/g、異槲皮苷0.21 mg/g、紫云英苷0.07 mg/g。分析提取黃酮類物質發現,有效成分存于細胞原生質體中,需克服細胞壁及細胞間質雙重阻力,才能擴散至提取介質中[9];致密的植物細胞壁組織結構形成的天然屏障[10],阻礙異槲皮苷等黃酮類天然活性物質的溶出。酶解法具有高效及專一性,選取植物組織特定酶,可催化降解木質素、纖維素、半纖維素等細胞壁組成成分,從而減少天然成分溶出的傳質阻力,提高天然產物提取量[11]。如李俠等[12]應用超聲-纖維素酶法提取綠豆皮黃酮類化合物,得率可達到0.831%,比單獨超聲波提取的得率提高了18.54%;李艷鳳等[13]利用復合酶(纖維素酶、果膠酶及半纖維酶)酶解提取銀杏葉中黃酮類化合物發現,適宜條件下復合酶對銀杏葉的細胞組織有較強的破壁力,總黃酮提取率比不加酶提高了36.6%。如何增大植物細胞的破壁能效、提高有效成分的溶出效率,進而實現桑資源的高效利用,對提升桑蠶業的整體效益和持續發展尤顯重要。

基于此,本文提出復合酶催化酶解桑葉植物組織強化浸提天然活性物質,選取黃酮類物質異槲皮苷溶浸量為評價指標,采用均勻設計法優化獲得異槲皮苷的適宜溶出參數,探究復合酶催化水解植物組織及其對黃酮類物質破壁溶出作用,為實現桑資源開發利用最大化提供技術研究及理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干桑葉粉 采摘自重慶市北碚區蠶桑研究院;乙腈(色譜純) 重慶川東化工集團有限公司;蘆丁(標準品)、異槲皮苷(標準品)、紫云英苷(標準品) 成都普菲德生物技術有限公司;纖維素酶(100 U/mg) 和氏璧生物科技有限公司;半纖維素酶(20 U/mg)、木瓜蛋白酶(800 U/mg) 上海源葉生物科技有限公司;漆酶(10 U/mg) 北京酷爾化學科技;無水乙醇、檸檬酸、磷酸(分析純)、溴化鉀(色譜純) 重慶川東化工集團有限公司。

1260高效液相色譜儀 美國貝克曼庫爾特有限公司;pH計 上海雷磁精密儀器有限公司;TDZ5-WS高速離心機 上海君竺儀器制造有限公司;EL104電子天平(0.0001 g) 塞多利斯科學儀器有限公司;Nexus 670傅里葉變換紅外光譜儀 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 復合酶設計及酶解反應 稱取過60目篩的干桑葉粉2 g于錐形瓶中,加入分配比為漆酶、纖維素酶、半纖維素酶、木瓜蛋白質量比為2∶1∶1∶26的復合酶,按體積比為1∶5加入無水乙醇10 mL及蒸餾水50 mL后,用質量濃度為0.5 g/mL的檸檬酸溶液調節pH,混勻后于一定溫度水浴酶解一段時間后,取出冷卻至室溫,過濾、離心(4000 r/min,10 min)、定容于100 mL得酶解提取液,待測。其中,復合酶組配根據預實驗結果、采用均勻設計法優化獲得。

1.2.2 黃酮類物質含量測定 采用高效液相色譜法測定酶解提取液或乙醇浸提液中黃酮類物質的質量濃度,色譜柱為Agilent TC-C18(2)柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為體積比為20∶80的乙腈和0.5%磷酸溶液,流速為1 mL/min[14],檢測波長為358 nm,柱溫為25 ℃,進樣量為10 μL。繪制桑葉異槲皮苷、蘆丁及紫云英苷的標準曲線分別為:Y=18597X-5.827(R=0.9994)、Y=20400X-20.394(R=0.9995)、Y=13147X-21.014(R=0.9985)。根據標準曲線計算異槲皮苷、蘆丁、紫云英苷的溶出質量濃度,進而計算桑葉黃酮類物質溶浸量,計算公式如下:

式(1)

式中,A為黃酮類物質溶浸量,mg/g;c為各黃酮類物質溶出濃度,g/L;v為提取液體積,mL;m為桑葉質量,g。

1.2.3 單因素實驗 根據預實驗結果,考察酶解時間(水平值為30、45、60、90、120、150、180 min)、酶解溫度(水平值25、30、35、40、45、50、55 ℃)、復合酶投加量(水平值為0.150、0.225、0.300、0.375、0.450、0.525、0.600、0.675、0.750 g)及pH(水平值為4.0、4.3、4.6、4.9、5.2、5.5、5.8)對異槲皮苷、蘆丁、紫云英苷等黃酮類物質的溶浸量的影響,并選取異槲皮苷溶浸量為評價指標,確定考察因素的適宜范圍值。其中,各因素的初始值為酶解時間60 min、酶解溫度35 ℃、復合酶投加量0.3 g、pH4.5,其余參數值按1.2.1選取。

表1 均勻設計因素水平與編碼

1.2.5 無酶乙醇溶浸 溶浸工藝中復合酶投加量為零,反應時間、水浴溫度、pH為均勻設計法優化所得酶解反應得適宜參數,其余參數與1.2.1中參數一致。

1.2.6 物相表征

1.2.6.1 掃描電子顯微鏡分析 掃描電子顯微鏡(SEM)是用細聚焦的電子束掃描樣品,樣品與電子束之間相互作用會產生大量二次電子,利用二次電子信號成像觀察樣品表面及斷口形貌并對此進行分析[15]。本試驗采用SEM法分析經酶解催化反應前后桑葉表面物相結構,其中電鏡工作電壓為15 kV、放大1250倍。

1.2.6.2 桑葉底物表面官能團FTIR分析 采用衰減全反射模式測定桑葉的傅里葉變換紅外光譜,分析酶解反應后底物表面化學物質的官能團種類及其變化,測定波數為4000～500 cm-1。

1.3 數據處理

所有試驗均重復3次,結果取平均值并計算標準誤差,運用Origin 8.5軟件繪制趨勢曲線圖。利用SPSS 19.0(statistical product and service solutions)軟件和VF 6.0(visual foxpro)軟件分析實驗數據,建立模型,計算獲得優勢酶解參數。

2 結果與分析

2.1 影響黃酮類物質溶出的酶催化因素解析

2.1.1 酶解時間對黃酮類物質溶浸的影響 酶催化活性中心與底物的接觸受酶解時間影響[16]。由圖1可知,三種黃酮類物質的溶浸量隨酶解時間先升后降,異槲皮苷、蘆丁在60 min時均達到最大值0.49、0.29 mg/g,紫云英苷在此時也有極大值0.50 mg/g。分析其原因可能是反應初期,隨著酶逐步與底物充分接觸,酶解破壁效率逐步提高,黃酮類物質溶浸量呈上升趨勢;隨著復合酶活性中心都被底物結合充分發揮了催化酶解作用,進而酶解效率逐漸趨于平緩[17];結合文獻對比復合酶酶解時間僅為單一酶(纖維素酶)[18]的12.5%。

圖1 酶解時間對桑葉黃酮類物質浸提量的影響

2.1.2 酶解活化溫度對黃酮類物質的影響 復合酶作為蛋白質,對溫度表現敏感。由圖2可知,三種黃酮類物質溶浸量隨著反應溫度的升高逐漸增加,在50 ℃時表現出最適宜溫度;此時異槲皮苷、蘆丁、紫云英苷溶浸量分別為0.89、0.50、0.57 mg/g。分析原因在于,在酶適宜溫度45～65 ℃的范圍內,溫度升高,活化分子數會相應增多,進而提高酶活性,促進酶解活化反應;溫度升高,天然活性物質分子運動速度雖加快,有利于活性物質的滲透、擴散、溶解[19],但酶隨溫度熱變性同時加快,酶活力減小,導致天然活性物質溶出量降低[17]。

圖2 酶解溫度對黃酮類物質浸提量的影響

2.1.3 復合酶投加量對黃酮類物質的影響 酶的投加量也影響單位體積酶活性中心數,進而影響單位時間酶反應速度。由圖3可知,當復合酶投加量由0.15 g增至0.6 g時,蘆丁溶浸量也迅速增加,最高可達0.67 mg/g;而異槲皮苷和紫云英苷酶催化溶出優勢明顯,分別在0.45 g出現最大溶浸量,但繼續增加復合酶投加量黃酮類物質并不更多溶出。分析原因,酶投加量的增加,加大了與底物接觸的酶活性位點[10];但隨著酶投加量的不斷增加,同時加大反應體系中其他天然產物的溶出競爭,影響異槲皮苷和紫云英苷的優勢溶出。

圖3 復合酶投加量對黃酮類物質浸提量的影響

2.1.4 pH對黃酮類物質的影響 酶蛋白分子表面極性基團隨體系pH的變化而發生不同程度的解離,影響酶活性部位構象[18]。由圖4可知,異槲皮苷、蘆丁和紫云英苷溶浸量隨體系pH的增大呈先增加后減小再增加再減小的波動趨勢,當pH為4.3時,三種黃酮類物質均達最高溶浸量,分別為1.67、0.70、0.81 mg/g。分析原因在于,本實驗的復合酶雖主要為木瓜蛋白酶,其最適pH范圍5～7,但其中少量的漆酶、纖維素酶及半纖維素改變了整個復合酶制劑的最適pH。溶液pH改變會破壞酶的空間結構且失活,影響酶活性中心催化基團的功能,從而影響植物細胞的破壁作用,及酶解反應的速率和酶解效率[20-21]。

圖4 pH對黃酮類物質浸提量的影響

2.2 酶解反應提取異槲皮苷的適宜工藝條件的探索

表6 黃酮類物質的不同浸提方法優勢比較

表2 均勻設計實驗結果

表3 回歸分析方程結果

表4 顯著性分析結果

表5 驗證結果

2.3 復合酶催化強化作用解析

2.3.1 桑葉底物表面官能團結構分析 谷緒頂等[23]采用紅外光譜圖解析植物底物表面官能團,證明微生物預處理破壞桑葉細胞壁,利于細胞中1-脫氧野尻霉素的釋放;何士成等[24]也通過FTIR圖譜表明,經堿液處理后,檸條、水稻秸稈和小麥秸稈的木質素結構受到一定程度的破壞。因此本文采用紅外光譜分析酶解反應后底物表面化學物質的官能團種類及其變化,如圖5所示,經過酶解后的桑葉殘渣在2920 cm-1處的吸收峰增強,為C-H伸縮振動[25],說明酶解作用破壞了植物組織使得更多的胞內物質溶出;桑葉的紅外譜圖中位于1390 cm-1是源于纖維素中的葡萄糖和半纖維素中木聚糖結構分子上的-CH2與O-H的彎曲振動的吸收峰[26],同樣酶解后的樣品在此處特征峰增強,說明復合酶中半纖維素酶作用于半纖維素使其發生分解,半纖維素與木質素之間的交聯結構被破壞。在2330、1564及1133 cm-1處的特征吸收峰分別是-C≡C-、>C=C<以及羧基的C-O的伸縮振動[25],表明酶解反應促進桑葉木質素中苯基丙烷結構單元分解,有利于桑葉植物組織中空隙的形成。酶解反應前后桑葉底物紅外譜圖反映出復合酶制劑在反應過程中對桑葉結構的破壞,即酶解反應對活性物質溶出的促進作用。

圖5 桑葉底物紅外光譜分析

2.3.2 桑葉植物組織結構形貌分析 實驗采用SEM法對比未經處理和經酶解活化反應后的桑葉粉末殘渣的表面物相結構變化,結果如圖6所示。由圖6(a)可知,未經處理的桑葉結構完整致密,圖6(b)可知經酶解活化后的桑葉表面受到一定程度的破壞,組織結構疏松空隙明顯增大,且出現眾多孔洞,說明復合酶對植物組織有破壁作用,新增的不規則空隙減少天然產物溶出的阻力,進而提高其溶浸量。

圖6 桑葉SEM掃描圖片

2.3.3 黃酮類物質破壁溶出作用解析 經過均勻設計優化得到的適宜酶解浸提條件下逐次增大反應底物的量由A1到A7(1,2,3,4,5,6,7 g),以期找到該條件下一定量復合酶的最大破壁效率。以各黃酮類物質的濃度增量為縱坐標,參加反應的底物增量為橫坐標繪制趨勢變化圖,實驗結果如圖7所示。由圖知各黃酮類物質在A5-A4點之前的增量趨勢線都是呈上升,說明該點為復合酶酶解破壁的最大效用點,即0.675 g復合酶在35 ℃下、30 min內對4 g桑葉粉進行酶解破壁作用效果最好。而后面兩個點的增量仍不穩定,甚至在A7-A6點處出現了驟然上升的趨勢,這是因為此類天然活性產物極性較大,通過相似相容原理也能被反應體系中乙醇部分溶出[27]。所以針對酶解破壁的效率來說,此酶解條件下最佳酶料比為0.169∶1,復合酶能夠高效快速的破壞細胞壁,使細胞質溶出,分解蛋白質、淀粉和果膠等雜質,提高目標成分的提取效率[28]。

圖7 黃酮類物質溶浸隨底物質量變化的影響

3 結論