百香果果皮總黃酮的超聲波輔助提取工藝優化及其性質研究

秦生華,李 珊,2,*,凌旭彬,龔尚昌,周貝紅,冼麗清

(1.百色學院化學與環境工程學院,廣西百色 533000;2.百色學院，桂西區域生態環境分析和污染控制重點實驗室,廣西百色 533000;3.百色學院材料科學與工程學院,廣西百色 533000)

百香果原產美洲熱帶地區,因果瓤多汁、氣味芬芳且富含氨基酸、維生素等營養物質,被譽為“果汁之王”[1]。我國南方地區廣泛栽培,其中廣西已經成為我國最大的百香果生產基地[2]。目前,果汁壓榨仍是百香果加工的主要方式,果皮則作為副產物直接舍棄或加工為牲畜飼料。文良娟課題組經研究發現,百香果果皮中含有大量的生物活性物質,如多糖、果膠、黃酮等[3]。因而,百香果果皮未經深加工即舍棄,不僅是資源的嚴重浪費,更由于其纖維含量大(>20%)易成為環境的負擔。提取百香果果皮中的活性成分,加快百香果高附加值產品的開發就成為了升級百香果產業結構的當務之急。

黃酮是一類以2-苯基色原酮為中心結構的化合物的統稱,在修復受損器官、調節機體新陳代謝等方面具有廣泛的生理活性[4-5]。根據其理化性質,黃酮類化合物常見的提取方法包括有機溶劑提取法、超聲波輔助提取法、酶解法及微波輔助提取法等。其中,超聲波輔助提取法具有操作簡便、時間短、效率高等優勢,在植物黃酮的提取研究中應用日益廣泛。目前,關于百香果果皮總黃酮的提取研究已有報道[6-7],如楊丹課題組采用乙醇-水溶液提取法提取紫果西番蓮(紫皮百香果)果皮中的總黃酮[8],提取率最高為1.17%,廖蘭課題組則采用逆流法進行提取[9],果皮總黃酮的提取率高達2.18%。然而,百香果果皮總黃酮的超聲波輔助提取研究仍未有報道,并且其生物活性方面的研究也十分缺乏。本文針對這一現狀,擬采用超聲波輔助乙醇-水溶液提取法提取百香果果皮中的總黃酮并優化工藝條件,隨后對總黃酮的生物活性如穩定性、抗氧化活性進行初步探討,以期為深化百香果的綜合開發及產品應用提供理論依據及數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

百香果 外皮完整無損傷無腐敗,百色市右江區城西大型農產品貿易市場;蘆丁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、水楊酸、過氧化氫(30%)、硫酸亞鐵、氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、鉬酸銨、抗壞血酸 分析純,北京華威銳科化工有限公司。

UV-2700紫外分光光度計 島津企業管理(中國)有限公司;KQ-202KDB型高功率數控超聲波清洗器 超聲波儀器有限公司;DHG-9030A智能數顯電熱恒溫鼓風干燥箱 上海坤天試驗室儀器有限公司;SHA-B恒溫水浴振蕩器 浙江力辰儀器科技有限公司;RE-2000B旋轉蒸發儀 鞏義市宇翔儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 百香果果皮粉末樣品的制備 百香果熟果,外皮完整無損傷無腐敗,去瓤去籽取果皮,切成邊長為1 cm的方塊,置于烘箱中60 ℃烘干至恒重。粉碎,過60目分樣篩,收集粉末置于密封袋中,低溫(2～4 ℃)干燥保存,備用。

1.2.2 單因素實驗 參考文獻[10-12],準確稱取1.000 g百香果果皮粉末,固定液料比40∶1 mL/g、提取溫度50 ℃、提取功率200 W、提取時間20 min,考察乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%、90%)對總黃酮提取率的影響;固定乙醇濃度70%、提取溫度50 ℃、提取功率200 W、提取時間20 min,考察液料比(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1 mL/g)對總黃酮提取率的影響;固定乙醇濃度70%、液料比50∶1 mL/g、提取功率200 W、提取時間20 min,考察提取溫度(30、40、50、60、70、80 ℃)對總黃酮提取率的影響;固定乙醇濃度70%、提取溫度60 ℃、液料比50∶1 mL/g、提取時間20 min,考察提取功率(120、160、200、240、280、300 W)對總黃酮提取率的影響;固定乙醇濃度70%、液料比50∶1 mL/g、提取溫度60 ℃、提取功率200 W,考察提取時間(10、15、20、25、30、35 min)對總黃酮提取率的影響。

1.2.3 響應面優化設計 分析單因素實驗結果,明確總黃酮提取率隨各因素變化的波動幅度,初步判斷各因素的主次順序。以總黃酮提取率為響應值,選取所考查因素中的主要因素(乙醇濃度、液料比、提取溫度、超聲功率)為自變量,利用Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken法設計優化試驗方案[13-14],如表1所示。

表1 響應面優化試驗因素水平表

1.2.4 百香果果皮總黃酮的提取及提取率的計算

1.2.4.1 蘆丁標準曲線的繪制 配制濃度為0.2000 mg/mL蘆丁標準品溶液。準確移取該溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL并分別置于10 mL具塞比色管中,50%乙醇稀釋至5 mL,混合均勻。繼續加入0.20 mL 5.0%亞硝酸鈉溶液、0.20 mL 10.0%硝酸鋁溶液、4.00 mL 4.0%氫氧化鈉溶液,50%乙醇定容,室溫反應15 min,在287 nm處測定體系吸光度[15],以吸光度Y對蘆丁濃度X(mg/mL)進行線性回歸,得:

Y=15.36X-0.9496,R2=0.9990

1.2.4.2 總黃酮的提取及提取率的計算 稱取一定質量的百香果果皮粉末,與相應比例的提取溶劑順序加入提取燒瓶中,在已設定好的提取溫度、超聲功率、超聲時間等條件下進行提取,反復三次。合并提取液,濃縮至30 mL,過濾。濾液轉移至50 mL容量瓶中,50%乙醇定容,即為總黃酮提取液。移取3.00 mL總黃酮提取液至10 mL具塞比色管中,按1.2.4.1所示流程測定體系吸光度,帶入回歸方程求取提取液中黃酮的濃度,按下式計算總黃酮提取率:

總黃酮提取率(%)=cv/m×100

式中:c為總黃酮濃度,mg/mL;v為總黃酮提取液體積,mL;m為果皮粉末質量,mg。

1.2.5 粗品總黃酮的純化 合并多批次總黃酮提取液,濃縮得棕褐色固體,即為粗品總黃酮。稱取一定質量的粗品總黃酮,混合50 mL二甲基甲酰胺(DMF)并置于超聲波萃取儀中,在超聲功率100 W,超聲溫度60 ℃下萃取20 min,反復2次,合并萃取液,過濾。濾液減壓蒸餾得DMF萃取物。DMF萃取物用蒸餾水溶解,30 mL三氯甲烷萃取,反復2次,合并萃取液,過濾。濾液蒸干得純品總黃酮[16-17]。稱取20 mg純品總黃酮,50%乙醇溶解并轉移至50 mL容量瓶中,50%乙醇定容,配制不同濃度(10、15、20、25、30 μg/mL)的總黃酮待測液。

1.2.6 總黃酮穩定性測試

1.2.6.1 溫度對總黃酮穩定性的影響 取4支潔凈試管,分別加入10 mL 85.85 μg/mL總黃酮待測液并置于40、60、80、100 ℃恒溫水浴鍋中,3 h內每隔0.5 h在510 nm處測定體系吸光度,考察溫度對總黃酮穩定性的影響[18-19]。

1.2.6.2 光照對總黃酮穩定性的影響 取4支潔凈試管,分別加入10 mL 85.81 μg/mL總黃酮待測液并置于黑暗環境、節能燈光(18 W,照射距離1.5 m)、晴朗日光(7月,照射時段12:00～15:00,外溫40 ℃)、紫外燈光(15 W,照射距離1.5 m)環境中,3 h內每隔0.5 h在510 nm處測定體系吸光度,研究光照對總黃酮穩定性的影響。

1.2.7 總黃酮抗氧化活性測試

1.2.7.1 對羥基自由基(·OH)清除效果的測定 取5支試管,分別依次加入2.00 mL不同濃度(10、15、20、25、30 μg/mL)的總黃酮待測液、2.00 mL 8.000 mol/L硫酸亞鐵溶液、2.00 mL 9.000 mol/L水楊酸-乙醇溶液,混合均勻后加入2.00 mL 1.0%過氧化氫溶液,振蕩均勻,室溫反應1 h,在510 nm處測定體系吸光度Ax[20-21]。固定上述試驗流程及相應條件,以蒸餾水取代總黃酮待測液并測定A0(空白吸光度);以蒸餾水取代過氧化氫溶液并測定Ap(對照吸光度),按如下公式計算總黃酮對·OH的清除率:

η(%)=[1-(Ax-Ap)/A0]×100

η(%)=[1-(Ax-Ap)/A0]× 100

1.2.7.3 總抗氧化力的測定 取5支潔凈試管,分別加入2.00 mL不同濃度(10、15、20、25、30 μg/mL)總黃酮待測液、3.00 mL 2.520 mol/L鉬酸銨-硫酸溶液,振蕩均勻,90 ℃恒溫反應90 min,在695 nm處測定體系吸光度Ax[24-25]。固定上述試驗流程及相應條件,以蒸餾水取代總黃酮待測液并測定A0,按如下公式計算總黃酮的總抗氧化力(總抗氧化力與吸光度成正比)。

η=Ax-A0

1.3 數據處理

本實驗結果使用Origin 9.0作圖;采用Design-Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken法設計優化試驗方案并對所得數據進行處理,獲取回歸模型及最佳提取工藝參數。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響 如圖1所示,在一定范圍內,總黃酮提取率隨乙醇濃度的升高而升高,當乙醇濃度為70%時,總黃酮提取率達到最高值1.24%。若乙醇濃度繼續增加,總黃酮提取率開始緩慢下降。黃酮為典型的有機化合物,易溶于乙醇等有機試劑,因而提取率隨乙醇濃度的升高而提高。但乙醇濃度過高,果皮中的色素等脂溶性物質也將進入提取溶劑中并擠占黃酮分子的溶出空間,導致其提取率下降。因此,乙醇濃度設定為70%比較合適。

圖1 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響

2.1.2 液料比對總黃酮提取率的影響 如圖2所示,總黃酮提取率先隨液料比的增大而升高,當液料比為50∶1時,總黃酮提取率達到最大值1.41%。繼續增大液料比則導致提取率下降。溶劑量的增加擴大了體系的擴散壓,促使黃酮分子盡可能多地擴散到溶劑中,得率升高。溶劑量過大,雜質分子亦被溶出,與黃酮分子競爭溶出空間導致提取率下降。因此,液料比設定為50∶1 mL/g比較合適。

圖2 液料比對總黃酮提取率的影響

2.1.3 提取溫度對總黃酮提取率的影響 如圖3所示,在較低的溫度范圍內,總黃酮提取率隨溫度的升高而升高,當提取溫度設定為60 ℃時,總黃酮提取率達到最高值1.56%。若溫度繼續升高,總黃酮提取率迅速下降。溫度升高,黃酮分子的運動活性增強,易擴散,提取率升高。但黃酮分子的酚式結構對溫度變化較為敏感,其結構易被高溫破壞,得率下降。因此,提取溫度設定在60 ℃比較合適。

圖3 提取溫度對總黃酮提取率的影響

2.1.4 超聲功率對總黃酮提取率的影響 如圖4所示,在一定范圍內,總黃酮提取率隨超聲功率的增加而升高,當超聲功率設定為240 W時,提取率達到最大值1.65%。超聲功率繼續增加,總黃酮提取率下降(超聲波清洗器額定功率300 W)。超聲波的機械作用可以高效率地破壞細胞壁,促使黃酮分子快速溶出,提取率升高。較高的超聲功率將加劇體系的空化作用,導致局部溫度過高并破壞黃酮的分子結構,提取率下降。因此,超聲功率設定在240 W較為合適。

圖4 超聲功率對總黃酮提取率的影響

2.1.5 提取時間對總黃酮提取率的影響 如圖5所示,總黃酮提取率隨提取時間的延長而升高,當提取時間為25 min時,總黃酮提取率為1.66%。繼續延長提取時間,總黃酮提取率基本處于平衡狀態。總黃酮含量一定,較長的提取時間可使黃酮盡可能提取完全,但易引入雜質,并造成時間、能源成本的增加。因此,提取時間設定在25 min比較合適。

圖5 提取時間對總黃酮提取率的影響

2.2 響應面實驗結果

2.2.1 響應面法設計優化試驗方案 單因素實驗結果顯示,總黃酮提取率隨提取時間變化波動幅度較小,為所考察因素中的次要因素,因此以乙醇濃度(A)、液料比(B)、提取溫度(C)及超聲功率(D)為因素,總黃酮得率為響應值(Y),進行響應面優化,安排并嚴格實施29個試驗點。優化試驗設計方案及結果如表2所示。

表2 優化試驗設計方案及結果

2.2.2 回歸方程方差分析 利用Design-Expert 8.0.6軟件對優化試驗方案所得數據進行分析,獲得百香果果皮總黃酮提取率(%)對乙醇濃度(A)、液料比(B)、提取溫度(C)、超聲功率(D)的回歸模型:

總黃酮提取率(%)=-22.15933+0.31020A+0.32633B+0.013767C+0.039275D-2.12500×10-3AB+5.75000×10-4AC+8.12500×10-5AD+2.25000×10-4BC+6.87500×10-5BD+2.25000×10-4CD-1.92167×10-3A2-1.89667×10-3B2-1.05917×10-3C2-1.24010×10-4D2

表3 回歸方程的方差分析

根據F值可知,考察因素對總黃酮提取率影響效果的主次順序為液料比>乙醇濃度>超聲功率>提取溫度,且各因素及其二次項的影響效果均為極顯著水平(P<0.01)。各因素之間存在交互作用,其中交互作用AB極顯著(P<0.01),交互作用CD顯著(P=0.0202<0.05),交互作用AC、AD、BC、BD不顯著(P>0.05)。

2.2.3 交互作用的響應面解析 利用Design-Expert 8.0.6作出各交互作用的響應面分析圖及等高線分析圖。響應面的陡峭程度與該交互作用的顯著性成正比,曲面陡峭程度越大說明該交互作用越顯著,曲面平緩說明影響不顯著[27]。等高線的橢圓率也可以直觀地反應交互作用的強弱,等高線橢圓率越大說明該交互作用越顯著,橢圓率小說明不顯著。由圖6可知,交互作用AB的響應面具有顯著的陡峭曲面,且其等高線成明顯的橢圓形,說明該交互作用可以顯著地影響總黃酮的提取效果。交互作用CD響應面的陡坡明顯但較AB面平緩,等高線橢圓率高,影響顯著。交互作用AC、AD、BC、BD的響應面比較平滑,等高線趨近于圓形,不顯著。

圖6 交互作用AB影響總黃酮提取效果的響應面分析圖

圖7 交互作用AC影響總黃酮提取效果的響應面分析圖

圖8 交互作用AD影響總黃酮提取效果的響應面分析圖

圖9 交互作用BC影響總黃酮提取效果的響應面分析圖

圖10 交互作用BD影響總黃酮提取效果的響應面分析圖

圖11 交互作用CD影響總黃酮提取效果的響應面分析圖

2.2.4 最佳工藝參數的確定及檢驗 利用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗方案進行優化,獲得百香果果皮總黃酮的最佳提取工藝:乙醇濃度61.38%,液料比59.39∶1 mL/g,溫度55.51 ℃,超聲功率245.29 W,在此條件下百香果果皮總黃酮的提取率可達2.21%。為方便試驗,將最佳工藝調整為乙醇濃度61%,液料比59∶1 mL/g,溫度56 ℃,超聲功率240 W,提取時間25 min,在此條件下進行5次平行試驗以驗證該工藝的可行性。結果表明,在所得最佳工藝條件下,百香果果皮總黃酮提取率可達2.19%±0.03%,與模型預測值2.21%相當(<1%),說明該條件可行。

2.3 穩定性測試結果

2.3.1 溫度對總黃酮穩定性的影響 由圖12所示,當溫度處于60 ℃以下時,總黃酮提取液吸光度略微下降后即處于平衡狀態,說明黃酮在較低的溫度范圍內具有較高的穩定性。當溫度升高至80 ℃以上時,黃酮提取液吸光度明顯下降,并且溫度越高降幅越大。由此可知,黃酮應低溫保存,并且在保存及應用過程中避免60 ℃以上的高溫。

圖12 溫度對總黃酮穩定性的影響測定

2.3.2 光照對黃酮穩定性的影響 由圖13所示,黑暗環境中總黃酮提取液的吸光度略有下降后即處于平衡狀態,說明黑暗環境中黃酮具有較高的穩定性。在光照條件下,節能燈光對黃酮影響較小;日光照射下,總黃酮提取液吸光度明顯下降;紫外燈照射下,黃酮提取液吸光度大幅度下降,以上結果說明黃酮對紫外線敏感,應置于棕色試劑瓶中避光保存。

圖13 光照對總黃酮穩定性的影響測定

2.4 抗氧化活性測試

2.4.1 對·OH清除效果的測定 ·OH是有機體中最具危害性的自由基,清除多余的·OH對于維護機體正常的生命活動具有重要意義。由圖14所示,百香果果皮總黃酮對·OH具有很好的清除能力,其清除能力隨黃酮濃度的升高而增強,并且在高濃度條件下清除率增速進一步加快。當總黃酮濃度為30 μg/mL時,對·OH的清除率可達81%,低于VC對·OH的清除能力。

圖14 百香果果皮總黃酮對·OH清除效果的測定

圖15 百香果果皮總黃酮對清除效果的測定

2.4.3 總抗氧化力的測定 黃酮類化合物的酮式結構可以轉化為酚式結構。由圖16所示,百香果果皮總黃酮具有較強的抗氧化能力,其總抗氧化力隨黃酮濃度的升高而增強,并且在高濃度條件下總抗氧化力增速加快。當黃酮濃度達到30 μg/mL時,其總抗氧化力為0.687,低于VC的總抗氧化力。

圖16 百香果果皮總黃酮總抗氧化力的測定

3 結論