乙醇硫酸銨雙水相萃取黃秋葵葉中的葉黃素

李 諾,鐘秋平,陳文學,陳衛軍,陳海明,云永歡

(海南大學食品科學與工程學院,海南海口 570228)

葉黃素是一種含氧類胡蘿卜素,可增強機體免疫力,具有抗氧化性,能夠保護人體免受自由基的損害[1-3]。人體自身無法合成葉黃素,只能從食物中獲取,特別是從綠色和黃色的水果蔬菜中獲得[4]。飲食中葉黃素的攝入可顯著降低糖尿病和胰腺癌的發病率[5]。葉黃素是嬰兒和兒童視覺和認知發展的重要調節劑,并在預防和治療與早產有關的疾病方面發揮重要作用[6]。熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所栽培的十幾個品系黃秋葵初步測定,黃秋葵葉片中含有豐富的葉黃素和β-胡蘿卜素,葉黃素的理想純產量最高達到9261.7 g/hm2[7]。而具有高附加值的黃秋葵葉常作為雞飼料的添加劑以增強雞的著色強度,高附加值沒有得到很好的體現[8]。目前黃秋葵葉的研究主要集中在品質分析方面,鮮有對黃秋葵葉葉黃素提取及抗氧化活性方面的報道。

隨著葉黃素需求的增加,葉黃素受到了廣泛的關注,因此迫切需要開發一種經濟有效的提取方法來獲得高產量的葉黃素。從天然植物資源中提取葉黃素的傳統方法包括有機溶劑萃取法、超臨界流體萃取法和酶法等[9]。有機溶劑萃取法雖操作簡單,但萃取耗時長、成品殘留污染,應用于食品、飼料等比較受限[10]。而超臨界流體萃取提取產品純度高,但操作繁瑣,且成本較高,不適用于工業的擴大生產[11-12]。而由兩種不同的聚合物或有機物與鹽組成的雙水相萃取系統利用簡單的設備及溫和條件下的簡單操作即可獲得較高的得率,具有環境生物相容性好、成本低、易于規模化生產等優點,可以替代傳統的有機溶劑萃取法[13]。雙水相萃取法在生物工程、藥物分析、色素提取等方面取得了一些階段性的成果,有著廣闊的應用前景[14],因此,利用雙水相萃取法提取葉黃素在工業生產中具有可行性和實用性。本試驗通過單因素結合響應面的方法確定黃秋葵葉葉黃素提取的最佳條件，以期為黃秋葵的進一步加工利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

黃秋葵葉 由海口芝燁農業科技有限公司提供;葉黃素標準品 上海源葉生物科技有限公司;硫酸銨 分析純,上海源葉生物科技有限公司;無水乙醇 分析純,西隴科學股份有限公司;所用水 均為超純水。

AR124CN電子天平 奧豪斯儀器有限公司;SK5200HP超聲波清洗器 上海科導超聲儀器有限公司;HH-4數顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司;KH-45A電熱恒溫干燥箱 康恒儀器有限公司;TU-1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 雙水相體系相圖制作 參照Huang等[15]的方法稍作修改,采用濁點滴定法制作乙醇-硫酸銨雙水相相圖。在含有一定濃度的硫酸銨溶液的試管中逐滴加入無水乙醇,直至溶液變濁,并記錄無水乙醇的量。根據30 ℃乙醇濃度和鹽濃度的記錄數據,繪制乙醇-硫酸銨雙水相相圖。

1.2.2 葉黃素粗提液的制備 準確稱取0.3 g凍干粉碎后的黃秋葵葉粉末,以1∶20 (g/mL)料液比加入無水乙醇,53 kHz超聲波超聲15 min,5000 r/min離心10 min,取上清液即葉黃素粗提液,備用。

1.2.3 雙水相萃取工藝 稱取一定量乙醇、硫酸銨、葉黃素粗提液、超純水于小燒杯中,總質量為10.00 g,將該雙水相體系振蕩30 s并靜置10 min,兩相分離時收集上相中的葉黃素,測定相比R和葉黃素的含量,并計算其分配系數K及得率Y[16],其中:

K=Ct/Cb

式(1)

葉黃素得率(mg/g)=萃取液中葉黃素質量(mg)/黃秋葵葉粉末的質量(g)

式(2)

式中,Ct表示頂相的葉黃素濃度,μg/mL;Cb表示底相的葉黃素濃度,μg/mL。

1.2.4 單因素實驗 選擇質量分數分別為5%的粗提液(即取0.5 g按1.2.2的方法制備的粗提液加入到10.00 g乙醇-硫酸銨雙水相體系中混合而成)和25%硫酸銨,分析質量分數為12%、14%、16%、18%、20%的乙醇對黃秋葵葉葉黃素萃取效果的影響;固定乙醇質量分數為14%,其他條件不變,分析質量分數為21%、23%、25%、27%、29%的硫酸銨對萃取效果的影響;固定乙醇和硫酸銨的質量分數分別為14%和27%,其他條件不變,分析質量分數為3%、4%、5%、6%、7%的粗提液對萃取效果的影響。

1.2.5 Box-Behnken試驗 根據單因素實驗結果,設計由硫酸銨質量分數、乙醇質量分數和粗提取液質量分數組成的三因素三水平17個組合的Box-Behnken實驗,以得率為響應值確定黃秋葵葉葉黃素萃取的最佳提取條件,選取的試驗因素和水平見表1所示。

表1 Box-Behnken 設計因素水平設計

1.2.6 超聲輔助萃取葉黃素的動力學研究 分別測定萃取溫度為303、308、313 K時超聲輔助萃取葉黃素粗提液的動力學曲線,并確定相關反應級數。根據等溫條件下的動力學公式

dW/dt=k(Wmax-W)n

式(3)

對式(3)進行積分,得到式(4)和式(5)

[Wmax1-n-(Wmax-W)1-n]/(1-n)=kt+a(n≠1)

式(4)

ln[Wmax/(Wmax-W)]=kt+a(n=1)

式(5)

式中:Wmax表示一定溫度下最大產物得率,mg/g;W表示在萃取時間t時的產物得率,mg/g;k表示萃取表觀速率常數;t表示萃取時間,min;a表示積分常數;n表示萃取反應級數。

1.2.7 葉黃素含量測定 準確稱量一定量的葉黃素標準品,在不同的25 mL棕色容量瓶中用無水乙醇準確制備濃度分別為5、10、15、20和25 μg/mL的葉黃素標準溶液。放置10 min后,用紫外可見分光光度計在445 nm下測定樣品的吸光度,同時以空白試劑為參照,繪制標準曲線方程:y=0.0354x+0.0082,R2=0.9996。其中,x是溶液中葉黃素的濃度,μg/mL;y是吸光度值。

1.2.8 抗氧化性評價 將黃秋葵葉葉黃素濃度稀釋為0.25、0.5、1、2、4 mg/mL,然后進行DPPH自由基和ABTS自由基清除能力試驗。

1.2.8.1 DPPH自由基清除能力測定 參照魏華等[17]的方法略有修改,首先在517 nm下,用無水乙醇將0.2 mmol/L DPPH溶液的吸光度稀釋至1.2～1.3。取4 mL配制的DPPH溶液與1 mL待測樣品混合均勻,在517 nm的波長下測定樣品的吸光值,并以等體積的無水乙醇替代樣品作為對照組。DPPH自由基清除率計算公式:

DPPH自由基清除率(%)=[(A0-A1)/A0]×100

式(6)

式中:A0表示未加樣的DPPH的吸光值;A1表示樣品與DPPH反應后的吸光值。

1.2.8.2 ABTS自由基清除能力的測定 參考范楊楊等[18]方法作適當修改,將0.2 mL 7.4 mmol/L的ABTS溶液與0.2 mL 2.6 mmol/L的過硫酸鉀溶液混合,避光條件下貯存12～16 h,用PBS溶液將ABTS自由基溶液的吸光度稀釋到0.70左右。取待測樣品0.2 mL,加入上述溶液3.8 mL后搖晃10 s,避光6 min后在734 nm的波長下測定吸光值,同時用PBS溶液替代樣品作對照。ABTS自由基清除率計算公式:

ABTS自由基清除率(%)=[(A0-A1)/A0]×100

式(7)

式中:A0表示對照組的吸光值;A1表示樣品的吸光值。

1.3 數據處理

單因素實驗和響應面試驗的結果分別采用OriginPro 8和Design-Expert.V8.0.6.1處理,所有試驗均重復3次,取平均值。

2 結果與分析

2.1 乙醇-硫酸銨雙水相體系的相圖

由相圖(圖1)可知乙醇與硫酸銨須在一定的比例和較大的質量分數范圍內才具有良好的成相能力[19]。由圖1可以觀察到曲線所劃分的兩個區域,曲線上方為兩相區,其中上相為富乙醇水相,下相為富鹽水相[20]。當鹽的質量分數維持在較高水平時,隨著乙醇濃度的不斷增加,曲線會出現形成雙水相體系的極值點,而過量的成相鹽在乙醇濃度較高時也會析出。因此,在接下來的實驗中,乙醇和成相鹽的質量分數應首先從雙峰曲線以上區域選取。

圖1 乙醇-硫酸銨雙水相體系相圖

2.2 單因素實驗

2.2.1 乙醇濃度對萃取效果的影響 如圖2所示,乙醇質量分數在12%～14%的濃度范圍內隨著乙醇濃度的增加,葉黃素的得率也逐漸增加,在乙醇質量分數為14%(w/w)時有最大得率和分配系數。之后隨著乙醇濃度的不斷增加,得率和分配系數均呈下降趨勢。可能是由于乙醇對水分子的競爭能力增強,使兩相更容易分開[21],葉黃素更傾向于上相,上相體積隨乙醇濃度的增加而增大,這有助于葉黃素在上相富集。但過高的乙醇濃度會導致鹽沉淀[22]。因此,確定適宜的乙醇質量分數為14%。

圖2 乙醇質量分數對葉黃素分配系數和得率的影響

2.2.2 硫酸銨濃度對萃取效果的影響 圖3可以看出,葉黃素的得率和分配系數在硫酸銨質量分數為21%～27%(w/w)范圍內隨硫酸銨濃度的增加而增加,并在硫酸銨質量分數為27%(w/w)時達到最大值;當硫酸銨質量分數由27%上升到29%(w/w)時,二者開始下降。隨著鹽濃度的增加,硫酸銨與乙醇爭奪體系中的水,導致水合能力增強,極性增大,上相體積減小,從而導致目標化合物的減少[23-24]。因此,適宜的硫酸銨質量分數為27%。

圖3 硫酸銨質量分數對葉黃素分配系數和得率的影響

2.2.3 粗提液濃度對萃取效果的影響 由圖4可知,在粗提液質量分數為6%時,葉黃素的得率和分配系數達到最大值,但隨著濃度進一步增加,二者開始減小。其主要原因是粗提液質量分數為6%時,葉黃素在乙醇相中達到飽和,如若繼續增加粗提液的濃度會造成原料的浪費[25],因此確定萃取粗提液的最佳質量分數為6%。

圖4 粗提液質量分數對葉黃素分配系數和得率的影響

2.3 響應面結果分析

2.3.1 響應面結果及方差分析 響應面法是一種多變量優化實驗的有效統計技術,以最少的運行次數確定最優工藝參數[26]。本實驗采用Box-Behnken響應面法對萃取過程中的關鍵影響因素進行優化,結果見表2。將所得的實驗數據進行多元回歸擬合,得到以葉黃素得率(Y)對乙醇質量分數(A)、硫酸銨質量分數(B)和粗提液質量分數(C)的二次多項回歸方程:

表2 Box-Behnken設計方案與結果

Y=1.96+0.075A+0.04B+0.035 C-0.055AB-0.04AC-0.03BC-0.13A2-0.042B2-0.063C2

為了檢驗方程的有效性,對乙醇-硫酸銨雙水相萃取葉黃素的數學模型進行方差分析,結果見表3。由表3可知,P模型<0.001,表明模型極顯著;失擬項P=0.5551>0.05,表明失擬項不顯著,即所選的二次回歸模型合理。模型決定系數R2=0.9142,說明模型擬合程度較好,可以充分反映各因素與響應值的真實關系。根據試驗結果得出最佳條件:粗提液質量分數6.14%、乙醇質量分數14.40%、硫酸銨質量分數27.46%，得率為1.98 mg/g。由自變量F值大小可知,各因素對葉黃素得率的影響由大到小依次為乙醇質量分數>硫酸銨質量分數>粗提液質量分數,說明在提取過程中影響葉黃素得率的首要因素是乙醇質量分數,這可能與原料特性有關。

表3 Box-Behnken 試驗結果的回歸分析

2.3.2 響應面優化及模型驗證試驗 通過Design-Expert8.0.6.1軟件對上述回歸方程繪制響應面曲線如圖5所示。通過響應面圖即可對任意兩因素對黃秋葵葉葉黃素得率的影響進行分析,從中確定最佳因素水平范圍。根據實際操作,對最佳條件修正為粗提液質量分數6%、乙醇質量分數14.5%、硫酸銨質量分數27.5%,在此條件下,黃秋葵葉中葉黃素的平均得率可達1.99 mg/g。與模型預測值基本吻合,這能夠有效說明該實驗選用的模型是合理的。

圖5 各因素交互作用的響應面圖

2.4 提取動力學

萃取反應的動力學級數是提取動力學的重要參考依據,即當動力學曲線最接近直線時所對應的n值[27]。分別在不同溫度下(303、308、313 K),改變萃取時間,獲得不同溫度下萃取葉黃素相應的最大產物得率和在萃取時間t時的產物得率。將n設為0.5、1和2,當n=l時,根據式(5)作圖;當n=0.5和2時,根據式(4)作圖。

如圖6所示,當n=2時曲線最接近直線,故超聲輔助萃取葉黃素符合二級動力學方程。

圖6 反應級數曲線

2.5 黃秋葵葉葉黃素抗氧化性分析

由圖7可以看出,葉黃素對DPPH自由基和ABTS自由基均有一定的清除作用。隨著葉黃素濃度的升高,其對自由基的清除能力逐漸增強,但均弱于陽性對照VC。一般以清除率為50%的樣品濃度IC50值來評價樣品的抗氧化性,IC50值越小,樣品的抗氧化性越強[28]。

圖7 黃秋葵葉葉黃素以VC為對照時對ABTS自由基(a)和DPPH自由基(b)的清除率

由圖7得到的擬合方程顯示在表4中,當黃秋葵葉葉黃素對ABTS自由基和DPPH自由基的清除率為50%時,葉黃素的IC50值分別為0.2841和0.7633 mg/mL,故葉黃素對ABTS自由基的清除能力更強。該值比馬娜等[29]鹽析法萃取萬壽菊花中的葉黃素清除DPPH自由基時的IC50值0.34 mg/mL大,說明從黃秋葵葉中提取的葉黃素對DPPH自由基的清除能力稍弱一些。

表4 葉黃素對不同自由基的IC50值

3 結論

通過單因素實驗對影響雙水相萃取黃秋葵葉中葉黃素的主要因素進行分析,根據單因素實驗結果,選擇較優水平設計Box-Behnken Design實驗,通過響應面法優化提取的工藝條件,經回歸方程方差分析及最優條件驗證,并根據實際操作,對最佳條件修正為:粗提液質量分數6%、乙醇質量分數14.5%、硫酸銨質量分數27.5%,在此條件下,黃秋葵葉中葉黃素的平均得率可達1.99 mg/g,且葉黃素萃取過程符合二級動力學方程。影響葉黃素得率的首要因素是乙醇質量分數,這可能與黃秋葵葉自身特性有關。采用本方法提取的黃秋葵葉葉黃素以VC為對照,對DPPH自由基和ABTS自由基均有一定的清除作用,并根據IC50值的比較得知,葉黃素對ABTS的清除作用更強些。

實驗表明利用乙醇-硫酸銨雙水相萃取黃秋葵葉中的葉黃素,工藝穩定可行,操作簡單,成本低,實驗的重復性好,且適合放大生產。