響應面法優化超高壓提取枸杞多糖工藝

楊孝輝,郭 君

(湖南化工職業技術學院,湖北株洲 412004)

枸杞(Lyciumbarbarum)是我國傳統的藥食同源植物[1],含有豐富的多糖[2]、維生素、植物黃酮、生物堿等物質,枸杞多糖具有抗氧化、免疫調節、抗癌、降血糖、降血脂[3]、抗衰老[4]、抗炎鎮痛[5]等作用,從枸杞中提取多糖,對充分利用枸杞資源、促進枸杞產業的發展具有重要意義。

多糖的研究和開發是目前的研究熱點之一,人們采用各種方法提取枸杞多糖[6-7]。水提醇沉法[8-10]是普遍使用的方法之一,工藝簡單、易操作,但提取溫度高,加熱時間長,易使提取的多糖轉化變質,降低純度。超聲波輔助法提取枸杞多糖的提取溫度低,能較好保持多糖生物活性,但相對其他方法,提取效率低[11-12]。微波輔助提取法適宜于熱敏性物質的提取,并具有高效、快速的特點,但可能存在多糖的降解,同時其設備的特殊性導致該方法較難用于工業化規模生產[13-14]。酶解法提取條件溫和,產品的收率和純度都較高,但高昂的生產成本限制了其工業化大規模生產[15-16]。超高壓提取技術是近年發展較快的提取技術,具有提取速度快、低耗能、高效率、無污染、條件溫和、易操作等優點,能夠在快速、完全提取有效成分的同時保持提取物的生物活性。魏煒等[17]采用超高壓提取技術對黃精多糖的提取工藝進行了優化,并將實驗結果與傳統水提取工藝進行對比,結果顯示超高壓提取法較傳統水提取法的多糖提取率提高了5.18%。目前未見采用超高壓提取枸杞多糖的相關文獻報道。

本研究采用超高壓提取技術,以枸杞多糖得率為考察指標,考察提取壓力、保壓時間、提取溫度、液料比四個因素的影響,利用響應面分析法對枸杞多糖的提取工藝進行優化,以期為枸杞多糖的進一步研究和開發利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枸杞 產地寧夏;D-無水葡萄糖標準品(純度﹥99.9%) 中國食品藥品檢定研究院;苯酚 天津市永大化學試劑有限公司;硫酸 成都市科龍化工試劑廠;乙醚、無水乙醇、硫酸亞鐵、雙氧水 天津市富宇精細化工有限公司;L(+)-抗壞血酸 廣州化學試劑廠;實驗所有試劑均為分析純；實驗用水均為新制二次蒸餾水。

L2-600/2型超高壓處理設備 天津華泰森淼生物工程技術股份有限公司;UV-2550型紫外可見分光光度計 島津制作所;AUW220D型分析天平 島津制作所;SF-130型中藥粉碎機 中南制藥機械廠;DHS-20A自動快速水分測定儀 上海力辰儀器科技有限公司;WGL-45B型電熱鼓風干燥箱 天津泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 枸杞多糖的提取工藝 取去除雜質的枸杞在50 ℃的電熱鼓風干燥箱中干燥至含水量小于2%,粉碎、過60目篩,用10倍量無水乙醚(W/V)浸提3 h脫脂,重復3次,過濾,揮去枸杞樣品中的乙醚,置硅膠干燥器中干燥,備用。稱取經乙醚脫脂處理的枸杞樣品10 g,以蒸餾水為提取溶劑,應用超高壓提取裝置提取枸杞多糖,提取液于30 ℃、-0.09 MPa條件下真空減壓濃縮至含水量為40%的濃縮液,室溫條件下往濃縮液中加入無水乙醇至溶液乙醇濃度達80%,5 ℃以下冷藏,靜置12 h,過濾,將過濾得到的沉淀物置表面皿上,于20 ℃、-0.1 MPa條件下真空干燥后得枸杞粗多糖。

1.2.2 單因素實驗 按照1.2.1方法萃取枸杞粗多糖,固定反應條件為提取保壓時間5 min、提取溫度45 ℃、液料比為20∶1 mL/g,考察不同提取壓力(100、200、300、400、500 MPa)對多糖得率的影響;固定反應條件為提取壓力400 MPa,提取溫度45 ℃、液料比為20∶1 mL/g,考察不同保壓時間(1、3、5、7、9 min)對多糖得率的影響;固定反應條件為提取壓力400 MPa、保壓時間7 min、液料比為20∶1 mL/g,考察不同提取溫度(25、35、45、55、65 ℃)對多糖得率的影響;固定反應條件為提取壓力400 MPa、保壓時間7 min、提取溫度55 ℃,考察不同液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 mL/g)對多糖得率的影響。進行單因素實驗,考察各因素變量對枸杞多糖得率的影響。

表1 響應面分析因素及水平

1.2.4 葡糖糖標準曲線的繪制 準確稱取干燥至恒重的無水葡萄糖標準品0.50 g,配成濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖對照品貯備液,從中分別精密吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于25 mL具塞試管中,各加水至1.0 mL,各加5%苯酚溶液1.5 mL,振搖混勻,滴加濃硫酸5.0 mL,迅速振搖均勻,于50 ℃下放置30 min,取出后冷卻至室溫,紫外可見分光光度法于490 nm波長下測定吸光度值[18],得標準曲線:y=0.3812x+0.0026,R2=0.9995,在0～100 μg/mL范圍內呈良好的線性關系。

1.2.5 枸杞多糖的測定 精密稱取枸杞多糖適量,按照1.2.4方法顯色并測定吸光度值,由標準曲線計算枸杞粗多糖質量,然后計算枸杞多糖得率。

多糖得率(%)=(枸杞粗多糖質量/枸杞樣品質量)×100

1.2.6 枸杞多糖對·OH的清除能力測定 取試管,分別準確加入0.2 mol/L pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液2.0 mL和1.5 mmol/L鄰二氮菲溶液1.0 mL,振搖,混勻,分別準確加入1.0 mL 1.5 mmol/L的硫酸亞鐵溶液,1.0 mL濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的枸杞多糖樣品溶液,振搖,充分混勻,再分別加入1.0 mL質量分數為0.01%的雙氧水。調整反應體系體積為6 mL,放置37 ℃的恒溫水浴鍋中保溫反應1 h,取出,用紫外可見分光光度計在536 nm波長處測定吸光度,測定數值記為AX。用1.0 mL水代替樣品溶液,同法操作,記錄測定數值A1,記為損傷組;用2.0 mL水代替樣品溶液和雙氧水溶液,同法操作,記錄測定數值A0,記為未損傷組。以L(+)-抗壞血酸(VC)作為參照物[19-20],計算枸杞多糖樣品對·OH的清除率。

·OH清除率(%)=[(AX-A1)/(A0-A1)]×100

式中:AX為樣品組吸光度;A0為未損傷組吸光度;A1為損傷組吸光度。

近年來，晚霜、倒春寒、冰雹等自然災害都會導致櫻桃減產甚至絕收。其中，倒春寒導致櫻桃花期授粉受精不良，每年櫻桃損失約20%的產量；雹災在果實膨大接近成熟期時危害櫻桃果實，可導致15%～85%的櫻桃受損；成熟期遇陰雨天氣，可導致近20%的櫻桃果實采前落果和裂果。雖然全區一直在增強對基地建設的支持力度，但絕大多數果園投入側重于保證櫻桃苗木的定植成活，少有果園在機耕道、生產便道、小水窖及其他必要農機的配套上實現相對完善，嚴重影響櫻桃果實采收后的運輸，增加了果品種植和采收成本，降低了種植戶的經濟效益，削弱了抵御自然災害的能力。

式中:A0為未加枸杞多糖溶液反應的吸光度;A1為加枸杞多糖溶液反應的吸光度。

1.3 數據處理

數據分析采用Design-Expert.V8.0.6進行試驗設計和數據處理。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 提取壓力對多糖得率的影響 由圖1可知,當提取壓力從100 MPa增加到400 MPa時,枸杞多糖的提取得率從2.54%增加到8.75%,并在400 MPa壓力時出現最大值;之后隨著提取壓力繼續增加,枸杞多糖提取得率降低。這是因為壓力增大,細胞變形破裂度升高,溶劑對枸杞顆粒的浸潤速度加快,細胞內的多糖溶出加快;但壓力過大,枸杞細胞破裂度加大,大量雜質從細胞內溶出,影響枸杞多糖的溶出[25],同時壓力過大也可能會破壞多糖結構[26]。因此,提取壓力選擇為400 MPa。

圖1 提取壓力對枸杞多糖得率的影響

2.1.2 保壓時間對多糖得率的影響 由圖2可知,當保壓時間從1 min增加到7 min時,枸杞多糖的得率從4.31%增加到9.18%,并在7 min時出現最大值;這是因為保壓時間的延長使溶劑和溶質接觸更加充分,枸杞多糖的提取得率增加;但保壓時間超過枸杞多糖的耐受時間后,枸杞多糖分子結構受超高壓作用而破壞,枸杞多糖提取得率下降。因此,保壓時間選擇為7 min。

圖2 保壓時間對枸杞多糖得率的影響

2.1.3 提取溫度對多糖得率的影響 由圖3可知,在25～55 ℃范圍內,隨著溫度的升高,枸杞多糖得率從5.55%提升到8.68%,這是由于枸杞多糖在水中的溶解度隨溫度的升高而增加。同時,溫度升高加快了枸杞多糖分子的熱運動,枸杞多糖的溶出和轉移加快;在55～65 ℃范圍內,枸杞多糖得率隨溫度升高降低,這可能是由于溫度超過55 ℃后,大量的雜質溶出,吸附了部分多糖,導致多糖得率降低。因此,提取溫度選擇為55 ℃。

圖3 提取溫度對枸杞多糖得率的影響

2.1.4 液料比對多糖得率的影響 由圖4可知,液料比在10∶1～20∶1 mL/g范圍內增加,枸杞多糖得率從6.48%升高到8.23%,這是由于溶劑用量增加,溶質濃度差加大,利于多糖溶出;液料比超過20∶1 mL/g后,溶質已溶出完全,溶劑增加,枸杞多糖得率趨于平緩。同時,過量的溶劑會導致后續濃縮工作量加大。因此,液料比選取20∶1 mL/g。

圖4 液料比對枸杞多糖得率的影響

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 試驗方案及結果 通過響應面法對超高壓提取枸杞多糖的提取壓力、保壓時間、提取溫度、液料比4個因素進行設計,試驗方案及結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果

采用Design-Expert.V8.0.6軟件對數據進行回歸擬合,得枸杞多糖得率Y對各因素回歸方程為:Y=9.07+1.08A+0.43B+0.21C+0.37D-0.100AB+0.060AC+7.5×10-3AD-0.015 BC+0.077BD+0.028CD-1.15A2-0.53B2-0.50C2-0.36D2

表3 回歸模型與方差分析

2.2.3 交互作用分析 圖5a～f表示各影響因素兩兩作用對枸杞多糖得率的交互影響。由得到的各影響因素交互作用的響應面3D圖和等值線可知,在所選范圍內各影響因素的相互作用存在極大值,既是響應面的最高點,同時也是等值線最小橢圓的中心點。由表3數據分析可知,提取壓力、保壓時間、提取溫度、液料比等影響因素的兩兩交互作用不顯著(P>0.05)。

圖5 各因素交互作用對枸杞多糖得率的影響

2.2.4 最佳條件的預測及驗證實驗 通過建立的模型預測枸杞多糖的最佳萃取工藝為:提取壓力445.91 MPa、保壓時間7.8 min、提取溫度57.5 ℃、液料比22.93(mL/g),理論多糖得率為9.54%。考慮到操作的實際情況,將最佳工藝條件修訂為:提取壓力446 MPa、保壓時間8 min、提取溫度58 ℃、液料比23 (mL/g),在此工藝條件下進行驗證實驗,做重復試驗3次,枸杞多糖得率平均為9.52%,與預測值9.54%誤差為0.21%,表明該模型能夠模擬和預測枸杞多糖的萃取,模型可靠。

2.3 枸杞多糖對·OH的清除能力測定結果

由圖6可知,在0～1.0 mg/mL濃度范圍內,枸杞多糖對·OH的清除率隨濃度的增加而增加,當枸杞多糖濃度為1 mg/mL時,對·OH的清除率可達76.98%,抗壞血酸濃度為1 mg/mL時對·OH的清除率為93.65%,相同濃度下,枸杞多糖對羥自由基的清除能力低于抗壞血酸。

圖6 枸杞多糖對羥自由基的清除能力

2.4 枸杞多糖對超氧陰離子自由基的清除能力測定結果

圖7 枸杞多糖對超氧陰離子自由基的清除能力

3 結論