米糠蛋白阿拉伯木聚糖接枝復合物制備及其功能性質研究

趙悅琳,田忠華,劉東旭,劉 暢,于 雷,*

(1.吉林農業大學食品科學與工程學院,吉林長春 130118;2.長春高新技術產業開發區預防保健中心,吉林長春 130012)

米糠蛋白是稻谷精加工的副產物之一,匯集了稻谷中60%以上的營養成分。米糠蛋白可以應用在食品中強化其營養價值[1];其還具有低致敏性,可以應用于針對特殊人群的食品中[2-3];同時米糠蛋白也具有抗癌、抗疲勞等功能[4]。但由于米糠蛋白中二硫鍵和表面疏水性氨基酸含量過多,使其溶解性差,限制了米糠蛋白的應用前景[5]。因此迫切需要對米糠蛋白改性。采用化學改性法可以使米糠蛋白的某些肽鏈斷裂,并產生新的官能團,從而改善米糠蛋白的功能性質。其中美拉德反應是化學改性中使用最為廣泛的方法[6-8]。

美拉德反應不需要化學催化劑,加熱條件下可以自發進行[9]。目前常用于美拉德反應接枝蛋白的多糖主要有葡聚糖[10-11]、殼聚糖[12-13]等。而以阿拉伯木聚糖接枝米糠蛋白的研究尚未見報道。阿拉伯木聚糖是植物細胞壁的主要成分,由β-(1→4)糖苷鍵連接的吡喃木糖單位的線性骨架組成[14]。糖基化產物由于引入阿拉伯木聚糖骨架中的羥基,既表現出糖類物質的親水特性又具有蛋白質的大分子特性,可有效改善米糠蛋白質的溶解性、持水性、乳化性等。

因此,本研究用阿拉伯木聚糖通過美拉德反應接枝米糠蛋白,制備米糠蛋白-阿拉伯木聚糖接枝物,在單因素實驗基礎上,采用響應面分析法優化制備工藝,并將制得的米糠蛋白-阿拉伯木聚糖接枝物與米糠蛋白進行持水性、乳化性及乳化穩定性的比較研究,以期為米糠蛋白在食品中的應用提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮米糠、玉米麩皮 吉林省萬昌米業有限公司;鄰苯二甲醛O Phthalic Aldehyde(OPA) 源葉生物有限公司;四硼酸鈉(分析純) 天津市大茂化學試劑廠;氫氧化鈉(分析純) 成都金山化學試劑有限公司。

BSA124S-CW電子分析天平 北京賽多利斯科學儀器有限公司;HW·SY21-K電熱恒溫水浴鍋 北京市長風儀器儀表公司;F5A低速自動平衡離心機 北京雷勃爾離心機有限公司;UWave微波-紫外-超聲萃取儀 上海新儀微波化學科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 米糠蛋白的制備 參考李帥斐堿提米糠蛋白方法有所改動[15]。取粉碎后的米糠粉20 g按照1∶9的料液比加入蒸餾水,攪拌均勻,調節pH為10。在50 ℃下提取90 min。然后在4000 r/min轉速下離心20 min,得到上清液A。將上清液A調節pH至4.5。在4000 r/min離心20 min,棄去上清液。凍干沉淀,得到堿提米糠蛋白,粗蛋白含量為13.7%。

1.2.2 阿拉伯木聚糖的提取 本實驗提取的是玉米麩皮中的阿拉伯木聚糖,參照Jiang等[16]堿提阿拉伯木聚糖的方法并有所改動。稱取定量的玉米麩皮粉,并加入0.3 mol/L氫氧化鈉溶液(含0.5% H2O2V/V),在萃取儀中以超聲功率500 W溫度70 ℃條件下萃取30 min,在4000 r/min轉速下離心20 min,得到上清液,用1 mol/L鹽酸調節pH至4.5,再次以相同條件離心上清液。用無水乙醇調節上清液濃度為65%。過夜沉淀,離心(4000 r/min,10 min)取沉淀部分,冷凍干燥,得到阿拉伯木聚糖粗提物。

1.2.3 米糠蛋白-阿拉伯木聚糖糖基化復合物的制備 稱取一定量的米糠蛋白(精確到0.001)[17],用pH為7的磷酸鹽緩沖溶液配制濃度為1%的蛋白溶液,按照一定的糖/蛋白質量比加入阿拉伯木聚糖,用氫氧化鈉溶液調節出有不同pH的溶液,磁力攪拌20 min使溶液混合均勻。密封后放入水浴鍋中,在一定的接枝時間、一定的接枝溫度下進行糖基化改性反應,反應一定時間后取出立即放入冰水混合物中冷卻。4000 r/min離心15 min除去不溶物,將上清液于4 ℃蒸餾水中透析24 h,將所透析的溶液冷凍干燥成粉末備用。

1.2.4 單因素實驗 以接枝度為指標,研究接枝溶液pH、接枝反應時間、阿拉伯木聚糖-米糠蛋白質量比、接枝反應溫度對接枝反應的影響。

1.2.4.1 接枝溶液pH對接枝反應的影響 分別選取pH8、9、10、11、12作為實驗條件,其他條件固定為接枝反應時間50 min、糖-蛋白質量比2∶1、接枝反應溫度50 ℃。研究溶液pH對接枝度的影響。

1.2.4.2 接枝反應時間對接枝反應的影響 分別選取接枝反應時間30、40、50、60、70、80 min作為實驗條件,其他條件固定為pH10、糖-蛋白質量比2∶1、接枝反應溫度50 ℃,研究反應時間對接枝度的影響。

1.2.4.3 阿拉伯木聚糖-米糠蛋白質量比對接枝反應的影響 分別選取1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1作為阿拉伯木聚糖-米糠蛋白質量比,其他條件固定為pH10、接枝反應時間50 min、接枝反應溫度50 ℃。研究糖-蛋白質量比對接枝度的影響。

1.2.4.4 接枝反應溫度對接枝反應的影響 分別選取接枝反應溫度30、40、50、60、70、80 ℃作為實驗條件,其他條件固定為pH10、接枝反應時間50 min、糖-蛋白質量比2∶1。研究反應溫度對接枝度的影響。

1.2.5 響應面試驗設計 在單因素實驗的基礎上,采用四因素三水平的響應面分析法對接枝溶液pH(A)、接枝反應時間(B)、阿拉伯木聚糖-米糠蛋白質量比(C)、接枝反應溫度(D)四個因素與接枝度(Y)進行響應面試驗設計。試驗設計如表1所示。

表1 響應面優化的因素及水平設計

1.2.6 接枝度的測定 采用OPA法[18],準確稱取40 mg的OPA溶于1 mL甲醇中,分別加入20%(W/V)SDS溶液2.5 mL,0.1 mol/L硼砂溶液25 mL,β-巰基乙醇100 μL,混合均勻后用蒸餾水定容至50 mL,得到OPA試劑。每次使用前即時配制。測定時,取4 mL OPA試劑于試管中,加入200 μL樣品液(5 mg/mL),混合均勻后于35 ℃水浴2 min,在340 nm處測定溶液吸光值A340,同時作空白對照。

式中:C0為原蛋白質自由氨基總量;Ct為在t時蛋白質自由氨基的含量。

1.2.7 持水性測定 根據李帥斐等[19]研究方法略有改動。準確稱取m1(約為0.5 g)的蛋白樣品至已知質量m2的離心管中,再加入10 mL的蒸餾水。混合均勻后在室溫下靜置30 min。然后在4000 r/min轉速下離心10 min。棄去上清液,將沉淀和離心管一起稱重,記為m3。

1.2.8 乳化性和乳化穩定性的測定 根據Kim等[20-21]研究方法略有改動。準確稱取 0.25 g蛋白樣品,加入0.1 mol/L pH為7.5的磷酸鹽緩沖液20 mL,然后加入10 mL大豆油,在均質機中均質2 min,立即從容器底部吸取50 μL,加入7 mL 0.1%的SDS溶液,混勻后在500 nm波長處測定其吸光度值,以SDS溶液作為空白。室溫放置10 min后再次從底部取樣測定。

式中:DF為稀釋因子,DF=101;ρ為蛋白濃度,g/mL;Φ為光程,Φ=0.01 m;θ為油相所占的分數,θ=0.25;A0為0 min時樣品的吸光值;A10為10 min時樣品的吸光值。

1.3 數據處理

試驗中所有數據均是3次測定平均值,采用Origin 8.5版本軟件進行作圖和數據處理分析,采用Design Expert 8.0.6軟件進行響應面分析,采用SPSS Statistics 19.0軟件對試驗數據進行統計分析。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 接枝溶液pH對接枝反應的影響 由圖1可以看出,隨著接枝溶液pH的增加,接枝度趨勢為先上升后下降,pH為10時接枝度達到最大值(P<0.05)。在pH8～10范圍內,米糠蛋白的溶解度增加,導致米糠蛋白和阿拉伯木聚糖的反應位點充分接觸,接枝度隨之增加。但高堿濃度會使米糠蛋白變性,同時發生米糠蛋白交聯,導致接枝度下降。因此,選定pH9、10、11作為響應面設計接枝反應溶液pH的因素水平。

圖1 接枝溶液pH對接枝反應的影響

2.1.2 接枝反應時間對接枝反應的影響 由圖2可知,米糠蛋白接枝物的接枝度在初始階段迅速增加,在50 min時接枝度達到最高點(P<0.05),這是因為米糠蛋白分子結構發生變化,開始解聚,分子內部的氨基與阿拉伯木聚糖結合,接枝度增加[22];隨著反應持續進行,接枝度在60～80 min內維持穩定。因為伴隨反應時間的加劇,蛋白水解逐漸飽和,接枝度幾乎不變(P>0.05)。因此,綜合各方面因素選擇40、50、60 min作為響應面設計接枝反應時間的因素水平。

圖2 接枝反應時間對接枝反應的影響

2.1.3 阿拉伯木聚糖-米糠蛋白質量比對接枝反應的影響 從圖3可以看出,阿拉伯木聚糖與米糠蛋白比值過高或過低都不利于接枝反應。當糖-蛋白質量比為2∶1時,接枝度達到最大值(P<0.05)。由此表明:在一定的糖度范圍內,適當地增加糖濃度,可以增加自由氨基與糖分子羥基的碰撞結合機率,使接枝反應向正反應方向進行。但當糖溶液濃度過大時,溶液的黏性增加,流動性降低,從而使分子間的相互作用放緩,不利于接枝反應正向進行。因此,選定糖/蛋白1∶1、2∶1、3∶1作為響應面設計阿拉伯木聚糖與米糠蛋白質量比的因素水平。

圖3 阿拉伯木聚糖-米糠蛋白質量比對接枝反應的影響

2.1.4 接枝反應溫度對接枝反應的影響 由圖4可以看出,隨著接枝反應溫度的升高,接枝度呈現先升高后下降的趨勢,在50 ℃取得峰值(P<0.05)。隨著反應溫度的升高,米糠蛋白結構開始疏松,米糠蛋白分子中的自由氨基含量升高,增加了自由氨基與阿拉伯木聚糖分子的羰基的反應速率,接枝度顯著升高(P<0.05)。但溫度過高會引發蛋白的熱變性和凝聚,自由氨基含量減少,引起接枝度降低。因此,選定40、50、60 ℃作為響應面設計接枝反應溫度的因素水平。

圖4 接枝反應溫度對接枝反應的影響

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 方差分析及回歸方程 表2展現了試驗設計及結果。采用Design Expert 8.0軟件對表2中的數據進行二次多項式擬合,得到接枝度的回歸方程為:

表2 Box-Behnken響應面試驗設計和結果

Y=33.81-0.44A-0.57B+0.12C+1.07D-2.06AB-0.72AC+1.75AD-0.69BC+0.48BD+0.31CD-2.08A2-2.66B2-0.59C2-1.41D2

表3 試驗模型方差分析

2.2.2 響應曲面分析及優化 圖5為各因素交互作用的響應面圖,響應面越陡峭,表明各因素間交互作用越顯著。不同變化趨勢說明各因素之間對接枝反應的影響具有差異性。綜合響應面圖的陡峭程度和F值可以得出四個因素對米糠蛋白-阿拉伯木聚糖復合接枝物接枝度的影響程度為:接枝反應溫度(D)>接枝反應時間(B)>pH(A)>糖-蛋白質量比(C)。根據回歸方程得到接枝復合物的最佳工藝參數:接枝溶液pH10.11,接枝反應時間48.61 min,阿拉伯木聚糖-米糠蛋白質量比2.23∶1,接枝反應溫度50.47 ℃。此條件下,制備的接枝復合物接枝度為34.07%。根據實際情況,選擇接枝反應溶液pH10,接枝反應時間48 min,阿拉伯木聚糖-米糠蛋白質量比2.2∶1,接枝反應溫度50 ℃。在此條件下,經過三次平行實驗,制備的米糠蛋白-阿拉伯木聚糖接枝復合物接枝度為34.01%,接近最佳條件預測值。

圖5 兩因素的交互作用對接枝反應的影響的響應面圖

2.3 接枝物的功能性質研究

2.3.1 持水性分析 由表4可知,三種樣品中,米糠蛋白-阿拉伯木聚糖混合物的持水性與米糠蛋白持水性差異不大,米糠蛋白-阿拉伯木聚糖接枝物的持水性最高(P<0.05)。這可能是因為美拉德反應破壞了米糠蛋白原有的高度規則和緊密排列的蛋白質肽鏈,使肽鏈疏松不規則而使持水性增加,另一方面可能由于阿拉伯木聚糖的引入帶來了親水基團,溶液中親水基團含量升高,持水性增加。

表4 米糠蛋白-阿拉伯木聚糖接枝物持水性分析

2.3.2 乳化性和乳化穩定性分析 如圖6,米糠蛋白與阿拉伯木聚糖接枝后,在pH4～10不同條件下接枝物的乳化性都顯著增加(P<0.05)。說明美拉德反應可以有效改善米糠蛋白乳化活性。這是因為通過糖基化反應引入阿拉伯木聚糖的親水基團,促使米糠蛋白更有效地吸附在油-水界面上,界面張力的下降增加了米糠蛋白的乳化活性。并且,阿拉伯木聚糖的引入使蛋白質緊密的結構打開，變得疏松,更有利于乳化。證明糖基化反應是改善米糠蛋白乳化性的有效途徑。

圖6 不同pH條件下三種樣品的乳化性變化

如圖7,測定了pH4～10不同條件下三種樣品的乳化穩定性。從圖7中可以看出混合狀態與米糠蛋白獨自存在時均呈現先升高后下降的趨勢,當pH>7時,米糠蛋白及糖蛋白混合物體系的乳化穩定性都大幅下降(P<0.05),這是由于過堿溶液使蛋白質大分子發生交聯,打破了原有的水油平衡。與此對比的是,在pH>8時,糖基化后形成的接枝物的乳化穩定性維持不變(P>0.05)。體系中阿拉伯木聚糖的存在一方面增加了油-水乳化體系中水相的黏度,使乳化體系的穩定性提高。另一方面,阿拉伯木聚糖的空間位阻作用使乳化劑形成的保護膜厚度增加,維持體系乳化穩定性不變。說明糖蛋白接枝物在較寬pH范圍內具有較好的乳化穩定性。

圖7 不同pH條件下三種樣品的乳化穩定性變化

3 結論

本實驗討論了美拉德反應改性條件對米糠蛋白糖基化接枝度的影響,通過響應面試驗建立了米糠蛋白-阿拉伯木聚糖糖基化改性工藝的模型,并對此模型進行了優化,得到米糠蛋白糖基化改性的最優工藝條件為接枝反應溶液pH控制在10,接枝反應時間48 min,阿拉伯木聚糖與米糠蛋白質量比2.2∶1,接枝反應溫度50 ℃,在此條件下,接枝度為34.01%。各因素對接枝反應的影響順序為:接枝反應溫度>接枝反應時間>pH>糖-蛋白質量比。經美拉德反應改性后的米糠蛋白持水性增加,乳化性和乳化穩定性明顯改善,為進一步工業化生產提供依據。后續試驗可針對最優工藝條件下的米糠蛋白糖基化改性產物的結構和功能性進行研究,探究米糠蛋白與阿拉伯木聚糖接枝反應的機理。