赤水白茶總黃酮超聲輔助提取工藝優化及其抗氧化活性

張劍霜,王地平,侯忠華,張 旭,李 艷,喻 浩

(1.貴州師范大學生命科學學院,貴州貴陽 550025; 2.貴州師范學院生物科學學院,貴州貴陽550018)

赤水白茶起源于云貴高原大婁山脈及其周邊地區,是大婁山區民間特有的古老茶種,在四川、重慶地區又稱作“老鷹茶”或“老蔭茶”[1]。赤水白茶主要是以樟科Lauraceae木姜子屬Litsea毛豹皮樟Litseacoreanalevl. var.lanuginosa植物的嫩芽或嫩葉為原料,經蒸制后,再曬干或炒制烘干而成[2]。赤水白茶茶湯色澤金黃,具有特殊的樟科植物的芳香味,在大婁山區已有悠久的飲用歷史,其味甘性寒,飲之可起到消暑解渴、止瀉和消食解脹之功效,是炎熱夏季倍受西南地區民眾喜愛的清涼飲品[3]。

赤水白茶中含有黃酮、多酚、多糖、維生素及微量元素等多種功能活性物質,其提取物具有多方面的生物活性,其中黃酮類化合物是赤水白茶中的主要活性成分[4-6]。目前,赤水白茶黃酮類成分提取多采用浸提法和熱回流法,但前者提取時間較長效率不高,而后者所需溫度較高會導致有效成分被破壞[7-8]。近年來,超聲輔助提取技術由于具有操作方便、耗時少和提取效率高等特點,被廣泛應用于多種食品化學成分的提取[9]。

本研究采用超聲輔助法提取赤水白茶總黃酮成分,在單因素實驗基礎上考察甲醇濃度、提取時間和液料比對赤水白茶總黃酮提取量的影響,結合Box-Behnken設計-響應面法考察影響赤水白茶總黃酮提取量的主要因素,建立二項式回歸模型,優化超聲輔助提取的工藝參數。采用多種體外抗氧化活性測定方法探討赤水白茶總黃酮的抗氧化活性,以期為赤水白茶資源的開發利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

赤水白茶 產自貴州省赤水市元厚鎮;蘆丁標準品(純度>99%) 購自北京索萊寶科技有限公司;維生素C(VC,純度>99%)、2,2′-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS,純度>98%)、乙二胺四乙酸(EDTA)、過硫酸鉀、無水甲醇 均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH,純度>97%) 購自日本東京化成工業株式會社;無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉等其它試劑 均為國產分析純。

UV759CR紫外分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司;DK-8D恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司;SB-5200DTD 超聲波清洗器 寧波新芝生物科技有限公司;FA2204B精密電子分析天平 上海精密科學儀器有限公司;Millipore Simplicity system超純水系統 美國默克公司;TD6多管架自動平衡離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司;QL-901 Vortex渦旋振蕩儀 江蘇海門其林貝爾公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 赤水白茶樣品預處理與總黃酮提取 將赤水白茶樣品于50 ℃烘箱中烘干至恒重,使用粉碎機粉碎后過80 目篩,保存于干燥器內。根據前期預實驗結果可知,相比乙醇和水,使用甲醇為提取溶劑所得總黃酮提取量最大;溫度為50 ℃時樣品總黃酮提取量最大,而超過此溫度后提取量有所下降;此外,超聲功率的變化(165～300 W)對赤水白茶總黃酮提取量無顯著影響;目前甲醇已用于多種食品中總黃酮的提取[10-13],因此后續實驗中選擇以甲醇為溶劑,溫度50 ℃,超聲功率210 W,并在此基礎上進行繼續優化。準確稱取0.05 g白茶粉末,按照液料比加入一定濃度的甲醇溶液,充分混勻后,在210 W功率和50 ℃下超聲輔助提取一定時間,然后室溫下以4000 r/min離心10 min,收集上清液,用于總黃酮提取量測定。

1.2.2 蘆丁標準曲線繪制 稱取100 ℃下干燥至恒重的蘆丁對照品0.02 g,用適量95%的乙醇溶解,定容至50 mL,得質量濃度為0.4 mg/mL的蘆丁標準液。分別準確吸取蘆丁標準液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL置于25 mL具塞比色管中,用蒸餾水補足至5 mL,加入5%的NaNO2溶液1.0 mL,充分搖勻,靜置6 min;再加入10%的Al(NO3)3溶液1.0 mL,充分搖勻,靜置6 min;繼續加入4%的NaOH溶液10 mL,混合后用蒸餾水定容至25 mL,搖勻并室溫放置15 min,以空白試劑做為對照,測定510 nm處吸光度[14]。以蘆丁濃度C為橫坐標,測得的吸光度值A為縱坐標繪制標準曲線,得回歸方程為:A=0.011C-0.0032,R2=0.9994。表明蘆丁對照品在8～48 μg/mL范圍內濃度與吸光度線性關系良好。

1.2.3 總黃酮提取量測定 采用硝酸鋁分光光度法測定總黃酮提取量[14]。吸取 0.7 mL 赤水白茶總黃酮提取液于25 mL 具塞比色管中,按照“1.2.2”中的方法進行操作,以空白試劑為對照,測定510 nm處吸光度,根據蘆丁標準曲線計算提取液中總黃酮濃度,再采用以下公式計算赤水白茶中總黃酮提取量。

式中:C-根據標準曲線計算出的黃酮質量濃度(μg/mL);V1-測定時的定容體積(mL);V2-提取液總體積(mL);V0-測定時所用提取液體積(mL);M-稱取的白茶樣品質量(g);RE-蘆丁當量。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 甲醇濃度對總黃酮提取量的影響 以液料比為100∶1 mL/g,提取溫度為50 ℃,提取時間為40 min,超聲功率210 W,考察甲醇濃度(30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%)對赤水白茶總黃酮提取量的影響。

1.2.4.2 液料比對總黃酮提取量的影響 以甲醇濃度為70%,提取溫度為50 ℃,提取時間為40 min,超聲功率210 W,考察液料比(50∶1、75∶1、100∶1、125∶1、150∶1、175∶1 mL/g)對赤水白茶總黃酮提取量的影響。

1.2.4.3 提取時間對總黃酮提取量的影響 以甲醇濃度為70%,液料比為50∶1 mL/g,提取溫度為50 ℃,超聲功率210 W,考察提取時間(10、20、30、40、50、60 min)對赤水白茶總黃酮提取量的影響。

1.2.5 響應面優化試驗設計 采用Box-Behnken試驗設計原理,以甲醇濃度、液料比和提取時間為自變量,樣品總黃酮提取量為因變量,在單因素實驗的基礎上,設計3因素3水平響應面試驗優化赤水白茶總黃酮提取工藝,實驗設計因素水平組合見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素及水平

1.2.6 赤水白茶總黃酮體外抗氧化活性測定

1.2.6.1 清除DPPH自由基能力測定 將赤水白茶總黃酮提取液加無水乙醇配制成總黃酮濃度分別為0.02、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的樣品溶液。取0.5 mL樣品溶液于具塞試管中,加入 0.15 mmol/L 的 DPPH溶液4.5 mL,充分搖勻,室溫下避光反應30 min,測定520 nm波長的吸光度As,每個濃度重復3次實驗。以0.5 mL純水替代樣品溶液與DPPH溶液混勻,測定吸光度Ab。以80%甲醇替代DPPH溶液與不同濃度樣品溶液混合,測定吸光度A0。以VC為陽性對照,精密稱取一定量的VC并配制與樣品溶液相應的濃度,按上述方法進行測定。DPPH自由基清除率按下列公式進行計算[15]。

1.2.6.2 清除ABTS自由基能力測定 將ABTS配制成7 mmol/L的溶液,與2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液混合后,避光放置12 h以上即得準備液,使用前用甲醇稀釋使其在730 nm的吸光度為0.7～0.8[16]。將赤水白茶總黃酮提取液加無水乙醇配制成總黃酮濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.10 mg/mL的樣品溶液。取樣品溶液0.5 mL,加入準備液5 mL,充分混勻后室溫避光反應6 min,測定730 nm吸光值As。以無水乙醇替代準備液與不同濃度樣品混勻,測定吸光度A0。以0.5 mL水替代樣品溶液,測定空白組吸光度Ab。以相應濃度的VC替代樣品溶液作為陽性對照。ABTS自由基清除率參考“1.2.6.1”中公式進行計算。

1.2.6.3 鐵離子還原法(Ferric ion reducing antioxidant power,FRAP)測定還原力 將赤水白茶總黃酮提取液加無水乙醇配制成總黃酮濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的溶液。取1.0 mL不同濃度樣品溶液與2.5 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L,pH=6.6)和2.5 mL鐵氰化鉀溶液(10 mg/mL)混合,50 ℃溫浴20 min,加2.5 mL三氯乙酸終止反應,3000 r/min離心10 min。取上清液2.5 mL、純水2.5 mL和FeCl3溶液(1 mg/mL)0.5 mL混合搖勻,測定700 nm吸光值,吸光值越高說明樣品的還原性越強[17]。以相應濃度的VC替代樣品溶液作為陽性對照。

1.2.6.4 金屬離子螯合能力(Metal chelating activity,MCA)測定 采用絡合菲洛嗪-Fe2+絡合顯色法測定樣品對金屬離子的清除能力,按照Damiani等[18]的方法進行適當修改。將樣品總黃酮提取液加無水乙醇配制成總黃酮濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL的溶液,取1 mL樣品溶液,加入1 mL的0.1 mmol/L硫酸亞鐵溶液和1 mL 0.25 mmol/L菲洛嗪,充分混勻后,室溫避光反應10 min,562 nm處測定吸光值As。用純水代替樣品測定空白對照組吸光值Ab,用水代替菲洛嗪測定不同濃度樣品對照組吸光值A0。以相應濃度的EDTA替代樣品溶液作為陽性對照。金屬離子螯合力按下列公式進行計算。

1.3 數據處理

采用SPSS 19.0統計軟件進行單因素數據方差分析,Design Expert 10軟件進行響應面試驗設計和結果分析,GraphPad Prism 7.0軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 甲醇濃度對總黃酮提取量的影響 甲醇濃度對赤水白茶總黃酮提取量的影響如圖1所示,在甲醇濃度30%～90%范圍內,赤水白茶總黃酮提取量隨著甲醇濃度呈現先上升后下降的趨勢,研究結果與鄧俊琳等[19-20]報道的甲醇濃度對總黃酮提取量的影響趨勢一致。在甲醇濃度較低時,黃酮類化合物的溶解度較低,隨著甲醇濃度升高總黃酮溶出率逐漸增加,在甲醇濃度70%時總黃酮提取量達到最大值(213.23 mg RE/g),此后由于溶液極性繼續下降脂溶性成分溶出增加,導致赤水白茶總黃酮提取量降低。

圖1 甲醇濃度對赤水白茶總黃酮提取量的影響

2.1.2 液料比對總黃酮提取量的影響 液料比對赤水白茶總黃酮提取量的影響如圖2所示,在液料比50∶1～100∶1 mL/g范圍內,赤水白茶總黃酮提取量隨液料比的增加呈逐漸升高,此后則呈相反趨勢。在低液料比條件下赤水白茶總黃酮提取量較低,可能是由于溶劑與樣品接觸不充分所致,當液料比為100∶1 mL/g時總黃酮提取量達到最大值(239.27 mg RE/g),而繼續增大液料比其它成分的溶出逐漸增加,從而導致黃酮類成分提取量降低[10]。

圖2 液料比對赤水白茶總黃酮提取量的影響

2.1.3 提取時間對總黃酮提取量的影響 提取時間對赤水白茶總黃酮提取量的影響如圖3所示,在10～20 min范圍內,赤水白茶總黃酮提取量隨著提取時間的延長而增加,此后繼續增大提取時間總黃酮提取量呈逐漸下降趨勢。當提取時間較短時,赤水白茶細胞中黃酮類物質還未完全溶出,在提取時間20 min時黃酮類物質基本完全溶出,提取量達到最大值(218.22 mg RE/g),繼續延長提取時間可能會引起高溫條件下黃酮類成分的降解,從而導致提取量降低[21]。

圖3 提取時間對赤水白茶總黃酮提取量的影響

2.2 響應面試驗結果

表2 Box-Behnken響應面試驗設計及結果

表3 響應面二次回歸方程方差分析結果

各因素交互作用對赤水白茶總黃酮提取量的影響的3D響應面圖和等高線圖見圖4～圖6,三維響應面圖可直觀體現交互項對響應值的影響,響應曲面坡度陡峭程度和等高曲線離散程度可反映不同因子間交互作用對響應值的影響,響應曲面坡度越陡峭、等高線越接近橢圓形則表明響應值對因素的改變越敏感[22]。圖4～圖6均為響應面開口向下的橢圓形曲面,圖4中響應面變化坡度較圖5和圖6更陡峭,并且等高線更接近橢圓形,表明甲醇濃度和提取時間的交互作用對總黃酮提取量的影響更大,與回歸模型方差分析結果一致。

圖4 甲醇濃度和提取時間對赤水白茶總黃酮提取量的影響

圖5 甲醇濃度和液料比對赤水白茶總黃酮提取量的影響

圖6 提取時間和液料比對赤水白茶總黃酮提取量的影響

采用Design Expert 10對回歸方程進行分析,得出赤水白茶總黃酮提取最佳工藝參數為:甲醇濃度68.66%,超聲時間24.46 min,液料比101.88 mL/g,此條件下所得赤水白茶總黃酮提取量最高,預測值為241.14 mg RE/g。結合實驗可操作條件,將最佳提取工藝參數修正為甲醇濃度69%,超聲時間24 min,液料比102∶1 mL/g,并在此條件下進行了有效性驗證,結果顯示總黃酮提取量為(243.50±1.16) mg RE/g,與預測值基本一致,并且無統計學顯著差異(P>0.05),表明該回歸模型所優化的赤水白茶總黃酮提取工藝參數可靠性高,具有實際應用價值。

2.3 體外抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除作用 DPPH自由基清除率實驗結果表明,赤水白茶總黃酮對DPPH自由基具有較好的清除作用,但較相同濃度的VC略低(圖7A)。在總黃酮濃度(Total flavonoids content,TFC)為0～0.20 mg/mL L范圍內,對DPPH自由基清除效果與總黃酮濃度呈正相關量效關系,DPPH自由基清除率隨總黃酮濃度的升高而增加,濃度為0.40 mg/mL時,對DPPH自由基清除率達到最大值90.1%。計算得到赤水白茶總黃酮對DPPH自由基的半數清除濃度IC50為0.082 mg/mL,高于VC(IC50=0.049 mg/mL)。

2.3.2 ABTS自由基清除作用 由圖7B可知,在赤水白茶總黃酮濃度為0.01～0.10 mg/mL范圍內,對ABTS自由基清除效果隨總黃酮濃度的升高逐漸增強,當濃度達到0.10 mg/mL時,對ABTS自由基清除率可達到99.8%,表明赤水白茶總黃酮對ABTS自由基具有明顯的清除作用,但清除效果相比同濃度的VC弱。計算得到赤水白茶總黃酮和VC對ABTS自由基的IC50分別為0.027和 0.018 mg/mL。

圖7 赤水白茶總黃酮抗氧化活性

2.3.3 鐵離子還原力 還原力能夠反映抗氧化劑的電子給出能力,還原力大小可作為抗氧化性強弱的重要指標[23]。由圖7C可知,赤水白茶提取物還原力大小與總黃酮濃度呈正相關量效關系,在低濃度范圍(0.1～0.8 mg/mL)內,赤水白茶總黃酮還原力弱于相同濃度VC,當濃度達到0.8 mg/mL后,赤水白茶總黃酮還原力大小與VC相當,表明赤水白茶總黃酮具有較強的還原力。

2.3.4 金屬離子螯合能力 金屬離子(Fe2+)通常作為誘發劑加速脂質的氧化過程,因此可通過測定抗氧化劑對金屬離子的螯合力來評價其抗氧化性。黃酮類成分中含有較多的酚羥基基團,可對金屬離子產生一定的螯合力。由圖7D可知,赤水白茶總黃酮對亞鐵離子的螯合能力隨濃度的增加而上升,相比同濃度EDTA的螯合力弱,計算得到赤水白茶總黃酮對亞鐵離子的IC50為0.781 mg/mL。

3 結論

本研究采用超聲輔助提取法提取赤水白茶中總黃酮,在單因素實驗的基礎上,應用Box-Behnken響應面試驗設計優化赤水白茶總黃酮提取工藝,獲得最佳工藝參數條件為:甲醇濃度69%,超聲時間24 min,液料比102∶1 mL/g,此條件下赤水白茶總黃酮提取量達到243.50 mg RE/g,與預測值相一致無顯著差異(P>0.05),表明所優化的赤水白茶總黃酮提取工藝可靠性高,可為后期的工業化提取作為理論參考。體外抗氧化活性實驗表明,赤水白茶總黃酮對DPPH自由基和ABTS自由基均具有較強的清除效果,清除率分別可高達90.1%(總黃酮濃度0.4 mg/mL)和99.8%(總黃酮濃度0.1 mg/mL),IC50值分別為0.082和0.027 mg/mL;對亞鐵離子具有較好的螯合能力,IC50值為0.781 mg/mL;在濃度為0.8 mg/mL時,還原力與VC相當;赤水白茶總黃酮具有較強的體外抗氧化活性,可作為一種天然抗氧化劑開發利用,提高其附加值和經濟效益。