超高效液相色譜串聯質譜法測定保健酒中紫杉醇的含量

楊曉聰,劉正才,,*,呂佳樂,林永輝,王丹紅,姚閩娜

(1.福建農林大學食品科學學院,福建福州 350002;2.福州海關技術中心,福建福州 350001;3.福州廣電計量檢測有限公司,福建福州 350001)

紫杉醇(Paclitaxel)是從紫杉樹皮中分離提取的二萜類天然化合物,可作用于微管蛋白,使其結構和功能發生改變,從而抑制腫瘤細胞繁殖,因此具有獨特的抗腫瘤作用[1]。紅豆杉是世界上公認瀕臨滅絕的天然珍稀抗癌植物,也是紫杉醇提取分離的唯一來源。目前已從紅豆杉屬植物分離鑒定出20余種黃酮類及雙黃酮類功效成分化合物,并被廣泛應用于醫藥、食品等行業[2],另外由于紅豆杉中可提取“紫杉醇”并用于治療癌癥,因此有很多人用紅豆杉果、樹皮、木片為原料制作紅豆杉保健酒[3]。紅豆杉保健酒含有的紫杉醇具有骨髓抑制、神經毒性、心臟毒性、肝臟毒性,大量服用會有抑制骨髓造血功能、白細胞下降等副作用[4-6],紅豆杉泡酒導致中毒的事故時有發生。原國家衛生部下發的《關于進一步規范保健食品原料管理的通知》里已經將紅豆杉列入保健品禁用物品名單,禁止將紅豆杉作為保健食品和食品原料使用。而目前對市場上非法銷售的紅豆杉酒的鑒定只是從標識和外觀上進行簡單的識別,尚未有科學的鑒定方法,故在監管上存在一定程度的漏洞,讓不法商家有機可乘,為保健酒的安全埋下了隱患。因此,除了各地衛生部門要加大監督檢查力度,嚴肅查處生產經營含紅豆杉食品的行為外,開發相關的檢測和鑒定方法也是十分必要的。

常用紫杉醇的檢測方法有分光光度法[7]、高效液相色譜法[8-10]、液相色譜-質譜聯用法[11-14]等。分光光度法在實際檢測過程中由于色素等雜質干擾導致定量準確性差、重現性低;高效液相色譜法對分離度要求高,分析時間較長;液相色譜-質譜聯用法由于高通量、高選擇性的優勢,已成為分析檢測紫杉醇化合物的主要手段。目前紫杉醇的分析主要集中在紫杉醇藥用研究[15-18]、提取與合成生產研究[19-24]、以及生物制品上的檢測[25-29],尚未發現保健食品中紫杉醇含量測定的研究。

本文選取紫衫烷中最常見的紫杉醇為研究對象,并對凈化條件和質譜、色譜檢測條件進行優化,建立了超高效液相色譜-串聯質譜法測定保健酒中紫杉醇的含量,該方法靈敏度高、選擇性好、結果準確可靠,可對保健酒的風險評估和檢測提供一定的參考依據,為識別和鑒定紅豆杉保健酒提供有效的技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅豆杉材料(根、莖、葉、果) 福建省寧德市古田縣卓洋鄉杉洋鎮紅豆杉林(海拔800 m);實驗用中藥材浸泡保健酒、紅豆杉果酒 福建省食品藥品檢驗研究院日常抽檢產品;紫杉醇對照品(CAS No.:33069-62-4) 純度大于98.0%,北京中科質檢生物技術有限公司;乙腈、甲醇、丙酮 色譜純,Fisher Scientific科技公司;甲酸 色譜純,德國Merck公司;實驗用超純水 美國Milli-Q超純水系統。

API5500超高效液相色譜-串聯質譜儀 美國Biosystems公司;XK80-A旋渦混合器 江蘇新康醫療器械有限公司;HN200多功能氮吹儀 濟南海能儀器股份有限公司;Milli-Q純水系統 美國Millipore公司;石墨化炭黑固相萃取小柱250 mg/3 mL 德國CNW科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 稱取紫杉醇對照品約5 mg,用甲醇溶解配制成質量濃度為100 μg/mL標準儲備液,于-20 ℃避光儲存。移取1 mL標準儲備液于100 mL棕色容量瓶中,用甲醇定容配制成質量濃度為1 μg/mL標準工作液,再根據需要配制成相應濃度的標準曲線。

1.2.2 供試品溶液的制備 移取1 mL保健酒樣品,置于10 mL容量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻后移取1 mL至預先用3.0 mL二氯甲烷-丙酮(70∶30,V/V)和3.0 mL甲醇活化的石墨化炭黑固相萃取小柱中,再用3.0 mL水和3.0 mL甲醇-水溶液(50∶50,V/V)分別淋洗,棄去流出液,移取3.0 mL二氯甲烷-丙酮(70∶30,V/V)進行洗脫,收集洗脫液,于45 ℃下用氮氣濃縮儀吹干。準確加入1.0 mL甲醇-水(5∶5,V/V)溶解殘渣,過0.22 μm有機濾膜,供液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.2.3 質譜條件 電離模式:電噴霧電離正離子模式;檢測方式:多反應監測(MRM)模式;紫杉醇母離子m/z 854.5;定量離子m/z 286.0,碰撞能量25 eV;定性離子m/z 569.3,碰撞能量15 eV;去簇電壓100 v;離子源噴霧電壓(Ionspray Voltage):5000 v;氣簾氣壓力(Curtain Gas):0.275 MPa;離子源溫度(Temperature):500 ℃;霧化氣壓力(Gas 1):0.345 MPa;加熱輔助氣壓力(Gas 2):0.345 MPa。

1.2.4 液相色譜條件 色譜柱:Luna? C8100A(150 mm×2 mm,3 μm);柱溫:40 ℃;流動相:A為0.2%甲酸水溶液,B為乙腈;梯度洗脫程序:0～5 min,15% B線性升至90% B;5～7 min,90% B不變;7～8 min B線性降至15%,保持2 min。流速:0.3 mL/min。進樣量:5 μL。

1.3 數據處理

實驗結果采用Excel 2010軟件、Origin 8.0軟件和ChemDraw 18.0軟件進行繪圖和處理。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

以針泵進樣的方式把紫杉醇標準液注入質譜儀中優化質譜條件。首先確定母離子和選擇離子檢測模式,分別考察了紫杉醇在正、負離子模式下檢測的響應情況,發現紫杉醇在ESI正、負離子模式掃描都能出峰,ESI負離子模式時母離子為m/z 852.5,ESI正離子模式時有加氫離子峰m/z 854.5和加鈉離子峰m/z 876.4,經MRM模式測試,m/z 854.5的響應值明顯高于m/z 852.5和m/z 876.4,且m/z 876.4出峰不穩定,因此本實驗選擇ESI正離子模式,母離子為m/z 854.5。確定目標母離子后,再對母離子施加一定的碰撞能量,使其產生特定的子離子,然后優化各化合物二級質譜的源內碎裂電壓、碰撞氣能量(CE)等參數,得到二級質譜圖(見圖1)。

圖1 紫杉醇標準品的二級離子碎片掃描質譜圖以及可能的裂解方式

2.2 色譜條件的選擇與優化

2.2.1 色譜柱的選擇 紫杉醇是一種含五甲基十五碳烯骨架的二萜類化合物,極性較弱,在以弱極性或非極性固定相的反向色譜柱中均有較好的保留,本實驗重點比較了紫杉醇在不同型號C18和C8色譜柱上的保留情況,實驗考察了Luna? C8100A(150 mm×2 mm,3 μm)、Luna? C18(150 mm× 2 mm,3 μm)和具有核-殼技術的Kinetex? C18(150 mm×2 mm,2.6 μm)3種色譜柱的分離效果(見圖2),結果表明,紫杉醇在Luna? C18柱上峰型較寬,Kinetex? C18柱上峰型窄,但前端有小的分叉峰,因此選擇Luna? C8100A(150 mm×2 mm,3 μm)色譜柱作為分析柱,沒有雜質干擾且峰型較好。

圖2 紫杉醇在不同色譜柱上的分離效果圖

2.2.2 流動相的優化 分別考察了以乙腈-水、甲醇-水作為流動相的測定結果,結果表明,以乙腈/水為流動相時,質譜信號較好。又考察了當使用乙腈-水、乙腈-5 mmol/L乙酸銨溶液、乙腈-0.2%甲酸、乙腈-5 mmol/L乙酸銨含0.2%甲酸溶液作為流動相時紫杉醇的分離和響應情況(見圖3)。試驗結果表明,流動相中加酸有改善峰型,增強響應值的作用;加入少量的乙酸銨對紫杉醇的響應值影響不大,甚至有抑制作用。為取得較高的靈敏度,選擇乙腈-0.2%甲酸水溶液為流動相,同時采用梯度洗脫法取得了較好分離效果。

圖3 紫杉醇在不同流動相的分離效果圖

2.3 樣品前處理

由于保健酒中通常含有30%～60%的乙醇,而乙醇對紫杉醇有很好的溶解性,除此之外,保健酒當中的色素、糖類、中藥成分在提取過程中可能會被一同提取出來[30-31],污染色譜和質譜系統的同時也會對試驗結果造成極大的干擾,因此必須選擇合適的凈化方法。試驗采用移取相同體積的空白基質配制200 ng/mL的紫杉醇標準溶液,分別用SPE(C18小柱和石墨化炭黑柱)凈化、QuEChERS凈化以及直接稀釋進樣法這四種凈化方法凈化后測定,考察不同凈化方法對響應值的影響(見表1)。結果表明,C18柱凈化時易堵塞,流速慢,耗時最長;QuEChERS凈化回收率偏低,重復性差;直接稀釋進樣法對色譜柱不利,且不能去除大部分色素;GCB柱是去除色素時常用的小柱,且能用低沸點的丙酮-二氯甲烷洗脫目標物,有利于后續氮吹濃縮步驟,提高檢測效率,實驗采用先稀釋10倍降低樣液中乙醇的比例,再用石墨化炭黑柱凈化,取得了較好的效果。

表1 紫杉醇在不同凈化條件下的凈化回收率(n=4)

2.4 基質效應考察

保健酒基質中含有色素、中藥類和糖類等成分,基質成分較為復雜,因此需要考慮消除基質效應所帶來的影響。根據Matuszewski等[32]的研究,本試驗采用陰性藥酒來配制基質匹配標準曲線(0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL 5個標準系列),用定容液配制同等濃度的標準曲線,以基質匹配標準曲線與標準曲線的斜率之比來考察化合物的基質效應。實驗結果表明保健酒中紫杉醇曲線比值為90.5%,基質抑制率為9.5%,而一般認為,基質曲線響應值與其標準曲線響應值的比值在85%～115%之間時不存在基質效應,因此基質對目標物質定量影響不大,本方法可以不考慮基質效應對定量的影響。

2.5 方法學驗證

2.5.1 線性關系 按本文方法配制一條系列質量濃度的混合標準溶液,在選定的色譜和質譜條件下測定后進行標準曲線的繪制。以目標組分峰面積(y)對目標組分的質量濃度(x,μg/L)作線性回歸分析,得到線性范圍、線性方程和相關系數。結果表明,紫杉醇在1～100 μg/L線性范圍內線性關系良好,計算得回歸方程y=474.63x+1.10×103,決定系數(R2)為0.9994,適合定量分析。

2.5.2 檢出限與定量限測定結果 在保健酒空白樣品中加入不同量的紫杉醇標準品后,稀釋后進行測定,對紫杉醇的檢出限和定量限進行評估,以3倍信噪比(S/N=3)為檢出限(LOD),計算檢出限為3.0 μg/L;以10倍信噪比(S/N=10)為定量限(LOQ),計算定量限為10.0 μg/L。

2.5.3 回收率和精密度 取空白保健酒作為添加回收試驗的基質,進行添加回收率和精密度的試驗。加標水平分別為10.0、50.0、100.0 μg/L,按1.2.2節進行樣品前處理,在1.2.3節和1.2.4節的條件下進行測定,每個加標水平做6組平行試驗。結果見表2,紫杉醇在10.0、50.0和100.0 μg/L 3個水平下的平均加標回收率為88.9%～92.4%,相對標準偏差(RSD)為7.8%～9.5%。

表2 保健酒中紫杉醇藥物在3個加標水平下的回收率(n=6)

2.6 實際樣品測定

應用本文所建立的方法,對15批市售含有枸杞、人參、葛根、桂圓等中藥材浸泡保健酒樣品中紫杉醇進行測定,均未檢出;從淘寶網上購得2批次紅豆杉果酒,均有檢出紫杉醇,且含量均超過方法定量限的100倍以上,其結果見表3,說明該方法特異性強,能夠簡單有效識別保健酒中非法使用紅豆杉的行為;同時為了解用紅豆杉不同部位泡制的保健酒中紫杉醇的溶出情況,分別取紅豆杉的根、皮、果、葉各10 g,分別裝入250 mL的棕色容量瓶中,用70%甲醇水定容至刻度,密封避光浸泡30 d后,搖勻,分別取適量上清液用0.45 μm濾膜過濾,再用水稀釋20倍,然后移取1 mL過GCB柱凈化,UPLC-MS/MS分析,其結果見圖4,實驗表明,紅豆杉的根、皮、果、葉泡酒均會浸出大量的紫杉醇,根部浸泡出的紫杉醇含量最高,風險最高,而葉子含量最低,該結論與文獻[33]報道一致。

圖4 紅豆杉中不同部位浸泡出紫杉醇的含量(浸泡液70%甲醇)

表3 市售17批保健酒樣品信息以及紫杉醇含量測定結果(n=3)

3 結論

通過色譜質譜條件、前處理條件和SPE條件的優化,建立了超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定保健酒中紫杉醇含量的方法。該法簡單、快速、靈敏度高,通過SPE的凈化可以去除大部分色素等雜質,方法特異性強、干擾因素少,可滿足復雜基質保健酒中紫杉醇含量測定的要求。該方法的建立對保健酒中紫杉醇的檢測提供依據,同時也對保健酒的風險監測和評估具有重要的意義。