高效液相色譜法檢測枯草芽孢桿菌發酵液中乙偶姻和2,3丁二醇含量

毛林靜,孟 武,王 瑩,王婧臻,王 慧,楚 杰,*

(1.山東農業大學動物科技學院,山東泰安 271018;2.齊魯工業大學(山東省科學院)生物研究所,山東濟南 250014;3.齊魯工業大學(山東省科學院)生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室,山東濟南 250353)

乙偶姻,又名3-羥基丁酮,具有特殊的奶油香味,是一種應用廣泛、令人喜愛的食用香料,是國際上常用的香料品種,主要用作奶油、乳品、酸奶和草莓型等香料的生產,也是酒類調香中一個極其重要的品種,國家標準GB 2760-86規定其為允許使用的食品香料[1]。同時,乙偶姻也廣泛應用于醫藥領域[2]、化妝品[3]、化工產品[4]和植物生長促進劑及植物病蟲害生物防治等農業領域[5]。2,3-丁二醇作為乙偶姻的還原產物[6],亦是一種重要的化工原料,常作為能源、航天航空[7]、橡膠樹脂制造[8]等。

目前,國際市場上的乙偶姻香料和2,3-丁二醇產品主要由美國、德國和日本的幾家大公司生產,并且主要為合成產品。然而合成法存在產品收率和得率較低,且環境污染較嚴重等缺點。而微生物發酵法具有環境友好、反應條件溫和等特點,越來越受人們關注。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)具有易培養、繁殖快、易保存、對環境適應強、無毒無污染等特點,可以生產高濃度的乙偶姻,并且菌株具有生物安全性,非常適合乙偶姻的生產。但枯草芽孢桿菌發酵過程中,在代謝產生乙偶姻的同時,也產生2,3-丁二醇,兩者存在可逆性,所以發酵過程中同時檢測這兩種物質的變化對高產乙偶姻的調控尤其重要。

目前關于國內外采用高效液相色譜法檢測乙偶姻的文獻報道較多,楊宇霞等[9]采用高效液相色譜法成功檢測出山西老陳醋中乙偶姻的含量,且證實該方法穩定高效精確度高。余書奇等[10]利用2,4-二硝基苯肼衍生-高效液相色譜法,采用紫外檢測器檢測葡萄酒中的乙偶姻,精確度高但方法復雜。湯丹丹等[11]采用高效液相色譜法檢測乙偶姻和四甲基毗嗪,并證實兩者之間呈正相關。張少飛等[12]建立了高效液相色譜法單獨測定山西老陳醋中的川芎嗪的方法。有報道采用溶劑提取食醋中的乙偶姻后直接經紫外光譜檢測[13],由于乙偶姻在紫外吸收處無特異性,干擾大,從而影響其回收率。但是,對于同時檢測乙偶姻和2,3-當二醇的文獻未見報道。

本文建立了使用高效液相色譜儀同時檢測乙偶姻和2,3-丁二醇的方法,以快速準確檢測枯草芽孢桿菌發酵液中二者含量,為后續枯草芽孢桿菌發酵調控生產高產乙偶姻提供方法依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌BS168 實驗室保藏;乙偶姻標準品(CAS號為513-80-6) 純度為99%,西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司;2,3-丁二醇標準品(CAS號為513-85-9) 純度為98%,國藥集團化學試劑有限公司;LB肉湯培養基、LB固體培養基 青島高科園海博生物技術有限公司;甲醇、乙腈(色譜級) 賽默飛世爾科技有限公司。

Waters高效液相色譜儀(帶示差折光檢測器) 捷島分析儀器有限公司;反向C18分析柱 上海漢堯儀器設備有限公司;真空抽濾機 天津恒奧科技有限公司;Bio-Rad Aminex HPX-87H糖分析色譜柱 美國伯樂;TGL-16G離心機 上海安亭科學儀器廠;Molecular摩勒分析型超純水機 上海摩勒科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準品前處理 以超純水(0.22 μm水系微孔濾膜過濾)為溶劑配制乙偶姻和2,3-丁二醇標準品濃度梯度分別為:50、40、30、20、10、5、2.5、1.25、0.625 g/L。

1.2.2 枯草芽孢桿菌發酵液的制備

1.2.2.1 種子活化 無菌條件下從LB固體斜面培養基中刮保藏的枯草芽孢桿菌取一環枯草芽孢桿菌菌體于50 mL LB肉湯培養基中,搖床37 ℃,180 r/min培養12 h。活化后按3%接種量接種于100 mL LB肉湯培養基中同樣條件繼續培養14 h作為種子液。

1.2.2.2 發酵培養條件 發酵培養基配方為:葡萄糖81.58 g,酵母浸粉10 g,尿素5.77 g,K2HPO410 g,玉米漿干粉5 g,MgSO41 g,MnSO40.08 g,純凈水1000 mL,pH=6.5。按3%接種量接種于裝有200 mL發酵培養基的500 mL錐形瓶中,搖床37 ℃、180 r/min發酵培養。

1.2.2.3 發酵液處理 取3 mL發酵液于5 mL離心管中,12000 r/min離心5 min,取上清,0.22 μm水系微孔濾膜過濾,裝入樣品瓶,4 ℃保存備用。

1.2.3 色譜柱選擇 以標準品出峰時間及峰高為指標,選用不同濃度梯度的標準品溶液作為待測物,流動相均采用色譜級有機溶劑。分別選取反向C18柱,示差檢測器,流動相分別為a.甲醇∶水(0.05%三氟乙酸)=90∶10、50∶50;b.乙腈∶水=90∶10、50∶50。進樣量10 μL,流速0.8 mL/min。Bio-Rad Aminex HPX-87H柱,選擇流動相為:0.005 mol/L的硫酸溶液。進樣量10 μL,流速0.5 mL/min。

1.2.4 線性范圍、相關系數及檢出限 準確配制乙偶姻和2,3-丁二醇標準品,濃度梯度分別為50、40、30、20、10、5、2.5、1.25、0.625 g/L;色譜條件采用流動相為0.005 mol/L的硫酸溶液(0.22 μm濾膜過濾),流速0.5 mL/min,分析柱為Bio-Rad Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm),示差檢測器,柱溫28 ℃進行檢測。

1.2.5 穩定性試驗 將乙偶姻和2,3-丁二醇標準品分別放置2、4、6、8、10 h,基于以上色譜條件檢測色譜峰面積[14]。

1.2.6 精密度試驗 將乙偶姻和2,3-丁二醇同一濃度的標準樣品在色譜條件下連續進樣檢測6次,對峰面積進行測定。

1.2.7 加標回收率測定試驗 取發酵48 h的發酵液,采用樣品加標的方法計算回收率。

回收率(%)=(C1-C2)/C3×100[15]。其中C1表示添加標準樣品后樣品的檢測質量濃度(mg/mL);C2表示未添加標準樣品時的檢測質量濃度(mg/mL);C3表示標準品的添加量(mg/mL)。

1.3 數據處理

試驗結果均采用平均值±標準偏差表示,數據采用SPSS 20.0軟件對結果單因子方差分析,P>0.05說明處理組之間差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 色譜柱的確定

2.1.1 反向C18分析柱 采用反向C18柱檢測,混合標準品色譜圖分別如圖1所示。

圖1 不同洗脫條件下乙偶姻和2.3-丁二醇色譜峰圖

由圖1可知,當色譜柱選取反向C18柱時,流動相選取乙腈-水或甲醇-水,流動相選取不同比例,混合標準品出峰時間一致且樣品峰與流動相峰重疊,不易分析與分離。查閱資料可知反向C18分析柱固定相的極性小于流動相的極性,乙偶姻和2,3-丁二醇標準品皆為純水溶解制備,極性大于流動相極性,故不宜使用此分析柱標準品混合物。

2.1.2 Bio-Rad Aminex HPX-87H糖分析色譜柱 色譜柱選取Bio-Rad Aminex HPX-87H糖分析色譜柱,流動相選取0.005 mol/L的硫酸溶液(0.22 μm濾膜過濾),流速0.5 mL/min,由于2,3-丁二醇在紫外無吸收峰[16],故采用示差檢測器。測得色譜圖如圖2所示。

圖2 乙偶姻、2,3-丁二醇混合標品色譜圖

由圖2可以看出,當選擇Bio-Rad Aminex HPX-87H 糖分析色譜柱時,選取流動相為0.005 mol/L的硫酸溶液,乙偶姻和2,3-丁二醇混合標準品出峰時間相差1 min,且峰形完好,乙偶姻出峰保留時間為21.646 min,2,3-丁二醇出峰保留時間為20.216 min。

最終確定色譜條件為如下:色譜分析柱:Bio-Rad Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm),pH范圍1～3;流動相:5 mmol/L H2SO4溶液=100%;進樣量:10 μL;流速:0.500 mL/min;柱溫箱:28 ℃;色譜柱溫:28 ℃;壓力:754±20 bar。

2.2 線性回歸方程及相關系數、檢出限

按照1.2.4方法進行線性回歸方程制作試驗,結果如表1所示,由表1可知,以乙偶姻和2,3-丁二醇的峰面積(Y)對相應的質量濃度(X)進行線性回歸,儀器檢出限分別為0.1和0.3125 mg/mL。以乙偶姻和2,3-丁二醇的峰面積(Y)對相應的質量濃度(X)進行線性回歸[17],乙偶姻和2,3-丁二醇相關系數分別為0.9997和0.9998,說明乙偶姻、2,3-丁二醇的濃度與峰面積有良好的線性關系,符合定量分析要求[18]。

表1 線性方程、相關系數及檢出限

2.3 穩定性試驗

根據方法1.2.5進行標準品穩定性試驗,結果見表2、表3,乙偶姻和2,3-丁二醇目標濃度為50 g/L。結果表明,相對標準方差RSD分別為1.2%和1.6%,均≤2%,說明標準品在10 h內穩定[19]。

表2 乙偶姻標準品穩定性試驗

表3 2,3-丁二醇標準品穩定性試驗

2.4 精密度試驗

按照方法1.2.6進行檢測方法的精密度試驗,結果見表4,由表可知,乙偶姻和2,3-丁二醇濃度的相對標準偏差分別為1.76%和1.74%,《中國藥品檢驗標準操作規范2010年版》規定,高效液相色譜法的精確度相對標準偏差≤2%。表明方法精密度較好[20]。

表4 精密度檢驗

2.5 加標回收率試驗

根據方法1.2.7進行加標回收率測定試驗,發酵液加標色譜圖見圖3、表5。從表5可以看出,乙偶姻、2,3-丁二醇的加標回收率在98.93%～102.10%之間,方法準確性較高,適合于枯草芽孢桿菌發酵液中乙偶姻和2,3-丁二醇的檢測分析。

表5 加標回收率試驗

2.6 高效液相色譜檢測不同時間段發酵液中的乙偶姻和2,3-丁二醇

采用上述試驗得出色譜條件檢測發酵液樣品,每個樣品設三個平行,分別在24、48、72、96、120 h取樣檢測發酵產物生成量并測pH,各個時間段不同乙偶姻及2,3-丁二醇含量含量見表6。

表6 不同時間段乙偶姻產量

由表6不同時間段發酵液中乙偶姻和2,3丁二醇含量變化趨勢可知,發酵前期,碳源和溶氧量充足,枯草芽孢桿菌利用葡萄糖一方面大量繁殖,一方面代謝合成產物乙偶姻。據文獻報道,高溶氧有利于乙偶姻的生成,較低的溶氧條件利于2,3-丁二醇的產生[21]。發酵后期,菌體量增加,培養基中溶氧、碳源含量下降,乙偶姻一部分作為碳源被菌體利用[22],一部分轉化為2,3-丁二醇[23]。在發酵初期至72 h,乙偶姻含量逐漸增加,72 h達到最大產量25.24 g/L。72 h之后,2,3-丁二醇呈迅速增加趨勢,120 h時含量達到23.73 g/L,而乙偶姻作為碳源被代謝利用而下降。乙偶姻含量在72 h最高,之后下降,說明當培養后期葡萄糖耗盡時,抑制消失,乙偶姻作為后續能源和碳源被細胞利用以保持細胞活性[24]。發酵后期pH穩定在6.5,菌體量下降不明顯。

3 結論

本文建立采用高效液相色譜法(示差折光檢測器)檢測枯草芽孢桿菌發酵液中乙偶姻和2,3-丁二醇的方法,發酵液前處理簡單易操作,檢測方法方便快捷、準確性、精密度高,色譜條件為流動相為0.005 mol/L的硫酸溶液(0.22 μm濾膜過濾),流速0.5 mL/min,分析柱為Bio-Rad Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm),示差檢測器,柱溫28 ℃進行檢測。其回收率在98.93%～102.10%,相對標準偏差為≤2%。該方法適合于整個發酵過程中發酵條件的優化以及發酵產物的實時監測[25],故可作為枯草芽孢桿菌發酵液中乙偶姻、2,3-丁二醇代謝調控的參考方法,為枯草芽孢桿菌在發酵過程中產乙偶姻和2,3-丁二醇的含量變化及調控發酵產物產量作監測依據。