翠云草揮發油成分分析、抗氧化及抗菌效果

雷 杰,黎維維,歐陽陳琳,馬先奎,王 剛

(遵義醫科大學藥學院,貴州遵義 563000)

翠云草(Selaginellauncinata),又名龍須、藍草、劍柏,是卷柏科卷柏屬多年生草本植物[1-2]。翠云草具有清熱解毒、化痰止咳、清熱利尿、利水消腫之功效。臨床上多用于治療急性黃疸型傳染性肝炎,膽囊炎,腸炎,痢疾,腎炎水腫,泌尿系感染,肺結核咯血等癥[3-4]。

關于翠云草的研究現主要集中于化學成分和生物活性方面。伍曉群等[5]采用大孔吸附樹脂、Sephadex LH-20柱色譜及制備高效液相色譜等分離技術,從翠云草75%乙醇提取物中鑒定出10種化學成分,主要含高級烷烴、醇、酚類化合物等。賴紅芳等[6]研究了翠云草不同提取溶劑的抗氧化活性,發現60%甲醇提取物抗氧化活性效果最好;肖凌等[7]從翠云草中分離出4個雙黃酮類化合物,分別是羅波斯塔雙黃酮-4′-甲醚、2,3,2″,3″-四氫穗花杉雙黃酮、2,3-二氫穗花杉雙黃酮、2,3-二氫穗花杉雙黃酮-4′-甲醚;在抗菌活性方面,吳穎瑞等[8]發現翠云草乙醇提取物對海豚鏈球菌有較強的抑制作用(MIC與MBC值分別為10,17.5 mg/mL)。目前未見文獻報道翠云草揮發油成分及生物活性。

本課題組以翠云草為原料,采用水蒸氣蒸餾法提取其揮發油,用GC-MS分離定性,進行體外抗氧化和抗菌活性試驗,旨在為翠云草這一傳統中藥材的綜合利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

翠云草 購自貴州遵義中藥材市場,經遵義醫科大學生藥學張玉金老師鑒定為真品;DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼) 購自東京化成工業株式會社;TPTZ(2,4,6-三(2-吡啶基)-1,3,5-三嗪) 購自于北京百靈威科技有限公司;菲洛嗪 購自東京化成工業株式會社;維生素C(VC) 購自國藥集團股份有限公司;EDTA(乙二胺四乙酸) 購自重慶九龍化學試劑廠;標準菌種(金黃色葡萄球菌 ATCC 25623、糞腸球菌 ATCC 29212、化膿性棒狀桿菌 ATCC 6051、大腸桿菌 ATCC 25922、銅綠假單胞 ATCC 19420、普通變形桿菌 CMCC 51352) 購自于成都金盛科技有限公司;三氯化鐵、無水硫酸鈉、正己烷、無水乙醇、醋酸鈉 均為國產分析純,購自于貴州三力試劑公司。

HP6890/5975CGC/MS聯用儀 購自美國Agilent公司;SC-3614型中草藥粉碎機 購自天津市泰斯特儀器有限公司;759型紫外—可見分光光度計 購自上海箐華科技儀器有限公司;FA1004B電子分析天平 購自上海滬粵明科學儀器有限公司;98-1-B型電子恒溫電熱套 購自天津市泰斯特儀器有限公司;揮發油提取器 購自北京欣威爾儀器有限公司;CO2恒溫培養箱 購自美國Forma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 翠云草揮發油的制備 稱取100 g樣品,粉碎過80目篩后在蒸餾水中浸泡2 h,在100 ℃微沸狀態下用蒸餾水提取6 h,收集餾出液,再用正己烷萃取3次,合并萃取液加入無水硫酸鈉干燥,再進行減壓濃縮回收正己烷,得到淺黃色有特殊香氣的翠云草揮發油0.52 g,得率為0.52%,重復三次提取,密封0～5 ℃下保存備用。

1.2.2 氣相色譜-質譜聯用儀工作條件 色譜條件[9]:HP6890/5975C GC/MS聯用儀,色譜柱為ZB-5MSI 5%,Phenyl-95% Di-Methylpolysiloxane(30 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細管柱,初始溫度54 ℃,保持2 min,以8 ℃/min升溫至126 ℃后,然后以4 ℃/min升溫至226 ℃,最后以8 ℃/min升溫至306 ℃,保持8 min,運行時間:54 min;汽化室溫度250 ℃;載氣為高純He(99.999%);柱前壓7.65 psi,載氣流量1.0 mL/min,進樣量1 μL,分流比20∶1,溶劑延遲時間:4.0 min。質譜條件:離子源為EI源;離子源溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃;電子能量70 eV;發射電流34.6 μA;倍增器電壓1482 V;接口溫度280 ℃;質量范圍29～500 amu。定性分析是通過HP6890/5975C化學工作站檢索Wiley7Nist05質譜圖庫和Nist05標準質譜圖庫解析,要求匹配度大于80%[10],半定量分析按峰面積歸一化法計算出各揮發性成分的相對百分含量。

1.2.3 抗氧化能力測定

1.2.3.1 DPPH自由基清除能力測定 參照文獻[11]方法稍作修改,分別量取2 mL不同濃度(0.02～0.12 mg/mL)的揮發油無水乙醇稀釋液與2 mL DPPH溶液(0.04 mg/mL)混合均勻,室溫下避光反應30 min,在517 nm波長處測定吸光度值A1,同法測定2 mL乙醇加樣液的吸光度A2,以及2 mL DPPH溶液與2 mL蒸餾水的吸光度A0,以維生素C作為對照,樣品對DPPH自由基的清除率Y(%)=[1-(A1-A2)/A0]× 100。

1.2.3.2 FRAP測定 參照文獻[12]方法稍作修改,精密量取25 mL 醋酸鈉緩沖液(pH=3.6)、2.5 mL TPTZ溶液和2.5 mL的FeCl3溶液按(10∶1∶1)的比例混合均勻,現用現配。吸取不同濃度(0.1×10-3～0.8×10-3mmol/L)FeSO4標準溶液0.1 mL,加入3 mL FRAP溶液,再加入0.3 mL蒸餾水,混勻準確反應8 min。以蒸餾水為空白,在593 nm處測定吸光度。以FeSO4標準溶液的濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,得到FeSO4標準溶液FRAP標準曲線,y=0.7865x+0.0916(R2=0.9995)。取不同濃度(0.02～0.12 mg/mL)的揮發油稀釋液0.1 mL于試管中,加3 mL FRAP溶液,再加入0.3 mL蒸餾水,混勻后反應8 min,以維生素C為對照,在波長593 nm處測定吸光度。

1.2.3.3 金屬離子螯合能力的測定 參照文獻[11]方法稍作修改,取不同濃度(0.02～0.12 mg/mL)的揮發油稀釋液1 mL于試管中,加入0.05 mL的FeCl2溶液(2 mmol/L)、2.8 mL蒸餾水和0.15 mL的菲洛嗪溶液(0.1 mmol/L),混勻后室溫放置10 min,于分光光度計562 nm處測定吸光度值A1。以相同濃度的EDTA做陽性對照,以相同方法測定其金屬離子螯合能力;以蒸餾水代替樣品做空白對照,測定吸光度值A0。金屬活性按該式計算:螯合率(%)=(A0-A1)/A0× 100。

1.2.4 抗菌能力測定

1.2.4.1 供試菌懸液和揮發油供試品溶液的制備 將試驗所有菌種分別取200 μL接種于10 mL肉湯培養基中,在35 ℃下活化18 h,然后根據0.5麥氏濃度標準調整細菌濃度,置于4 ℃冰箱中備用。將制得的翠云草揮發油按照倍比稀釋法,用二甲基亞砜(DMSO)作為溶劑,將其稀釋成40、20、10、5、2.5、1.25 μL/mL 6個濃度梯度的溶液。

1.2.4.2 揮發油抑菌活性的測定 采用紙片擴散法[13]。取翠云草揮發油原油100 μL滴到直徑為6.0 mm的濾紙片上,貼于用100 μL細菌懸液涂布的平板上,以純DMSO作為對照,將其在37 ℃條件下培養24 h。由此測量抑菌圈的直徑,重復3次。

1.2.4.3 揮發油的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測定 參照文獻[14]的步驟并稍作修改。將翠云草揮發油稀釋液分別加入菌懸液,37 ℃培養12 h,觀察結果,無肉眼可見的細菌沉淀所對應的濃度為最小抑菌濃度(MIC)。取MIC對應的培養液100 μL接種到肉湯培養基中,37 ℃培養24 h后,培養基上沒有觀察到細菌生長的濃度為最小殺菌濃度(MBC)。

1.3 數據處理

試驗重復三次,試驗數據采用OriginPro 8.5軟件進行處理分析。

2 結果與討論

2.1 GC-MS分析

對翠云草揮發油的分析,共分離出52個峰,并通過氣相色譜面積歸一法計算出揮發性成分在揮發油中的相對百分含量總離子流圖見圖1,具體分析結果見表1。結果表明,有50種成分被鑒別出,鑒出化合物的相對含量占到總峰的98.58%,揮發油成分主要包括萜類,脂肪酸及高級脂肪烴類化合物。在已鑒定的化合物中,相對百分量在1%以上的有15種,占被檢出物質總量的86.03%,其主要的化學成分包括植酮(21.40%)、角鯊烯(8.53%)、棕櫚酸(6.71%)、二十八烷(6.03%)等,其中含量最高的為植酮(21.40%)。

表1 翠云草揮發油的化學組分

圖1 翠云草揮發油總離子流圖

續表

最近研究表明,植酮是維生素E醋酸酯的中間體,同時也是煙草煙氣重要的特征香成分,具有一定的抗腫瘤活性[15-16]。角鯊烯是人體膽固醇代謝途徑中一個關鍵的中間產物,是所有類固醇類物質的生物合成前體,具有殺菌、增強細胞的活力及免疫力、抑制癌細胞生成及防止癌細胞擴散等作用,還有較好的養顏、潤膚等功效,應用于化妝品、保健食品、醫藥等領域[17-18];棕櫚酸用作沉淀劑、化學試劑及防水劑,其生理學和藥理學活性十分廣泛,還具有抗腫瘤作用,作用于乳腺癌和結腸癌[19-20]。

2.2 抗氧化活性測定

2.2.1 翠云草揮發油對DPPH自由基清除能力 由圖2可知,當翠云草揮發油濃度在0.02～0.12 mg/mL時,對DPPH自由基清除率不斷增大,當濃度為0.12 mg/mL時,翠云草揮發油對DPPH自由基清除率為65.28%,而維生素C對DPPH自由基清除率可達80.78%,翠云草揮發油清除DPPH自由基的半數抑制濃度IC50為0.76 mg/mL,維生素C的IC50為0.44 mg/mL,兩者比較,翠云草揮發油對DPPH自由基清除能力較弱于維生素C。以上結果顯示,翠云草揮發油具有較好的DPPH自由基清除作用。

圖2 揮發油對DPPH自由基清除率

2.2.2 翠云草揮發油的抗氧化活性 由圖3可知,當翠云草揮發油濃度在0.02～0.12 mg/mL時,對鐵離子的還原能力不斷增大,當濃度為0.12 mg/mL時,翠云草揮發油的FRAP值為0.86 mmol/L,而維生素C的FRAP值為0.89 mmol/L,兩者比較,翠云草揮發油對鐵離子還原能力較弱于維生素C。以上結果顯示,翠云草揮發油對鐵離子具有良好的還原作用。

圖3 樣品溶液和對照品溶液FRAP值比較

2.2.3 翠云草揮發油對金屬離子的螯合能力 由圖4可知,當翠云草揮發油濃度在0.06～0.12 mg/mL時,對金屬離子螯合能力不斷增大,當濃度為0.12 mg/mL時,翠云草揮發油對金屬離子螯合率為63.60%,而EDTA對金屬離子螯合率可達68.75%,翠云草揮發油對金屬離子螯合能力的半數抑制濃度EC50為0.71 mg/mL,EDTA的EC50為0.32 mg/mL,兩者比較,翠云草揮發油對金屬離子螯合能力較弱于EDTA。以上結果顯示,翠云草揮發油具有較好的金屬離子螯合能力。

圖4 翠云草揮發油對金屬離子的螯合作用

2.3 抗菌活性測定

通過測定翠云草揮發油對金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、化膿棒狀桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和變形桿菌的抑菌圈直徑大小、最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC),比較翠云草揮發油對這6種供試菌的抑菌效果,結果見表2。

表2 翠云草揮發油抗菌活性測試

總體而言,翠云草揮發油對革蘭氏陽性菌的抑制作用優于對革蘭氏陰性菌的抑制作用。其中,翠云草揮發油對糞腸球菌的抑制作用最強(抑菌圈直徑為17.94 mm,MIC為5 μL/mL,MBC為10 μL/mL),其次是化膿棒狀桿菌(抑菌圈直徑為14.63 mm,MIC為10 μL/mL,MBC為20 μL/mL),對大腸桿菌和銅綠假單胞菌也有一定的抑制作用,但是當翠云草揮發油濃度達到最大時,金黃色葡萄球菌和變形桿菌的MIC值尚未獲得,所以翠云草揮發油對這兩種細菌的抑菌作用較差。

3 結論

通過以上研究可知,利用GC-MS對翠云草揮發油的化學成分進行分析,鑒定出50個組分,占總峰面積98.58%,主要化學成分為:植酮、角鯊烯、棕櫚酸、二十八烷等。翠云草對DPPH自由基清除能力,鐵離子還原能力及金屬離子螯合作用的實驗均表現出較好的效果;翠云草揮發油具有較強的抑菌活性,對糞腸球菌的抑菌作用最強,其次是化膿棒狀桿菌。以上結論說明翠云草揮發油是一種有待開發的具有抗氧化和抗菌作用的天然活性物質,由于翠云草揮發油的組分種類豐富多樣,其抗氧化抗菌的機理還有待進一步研究。